3種桑蟥基因組DNA提取方法比較研究

王鈺婷 汪泰初 李瑞雪 王偉

摘 ?要：為了探尋一種高效、穩定、廉價的桑蟥基因組DNA提取方法，通過采用CTAB法、蛋白酶K法和鹽析法3種方法研究桑蟥基因組DNA的提取。對提取的DNA進行分光光度值的測定以及COI基因的擴增鑒定。結果表明：3種方法均可以提取基因組DNA，蛋白酶K法和CTAB法DNA獲得率優于飽和NaCl法提取的DNA，3種方法提取的DNA都可用于PCR擴增實驗。因此，在實際工作中可根據實驗目的、條件選取最適合的方法。

關鍵詞：桑蟥;DNA提取;CTAB法;蛋白酶K法;鹽析法

中圖分類號：S-186 ? ?文獻標志碼：A ? ?論文編號：2014-0684

Comparison of Three Methods for Genomic DNA Extraction from the Rondotia menciana Moore

Wang Yuting， Wang Taichu， Li Ruixue， Wang Wei

（The Sericultural Research Institute， Anhui Academy of Agricultural Science， Hefei 230061， Anhui， China）

Abstract： To explore an efficient， stable， low-cost DNA extraction method from Rondotia menciana Moore， genomic DNA was extracted using CTAB， protein enzyme K and salting-out method， respectively. The extracted genomic DNA samples of three methods were tested using photometric analysis and COI gene amplification. The results showed that， all the three methods can be used for the total DNA extraction， which are suitable for the PCR amplification， but genome DNA extracted by CTAB method and protein enzyme K method were higher in purity and production， degraded slightly. So we should select the proper method according to the objective and condition in the study.

Key words： Rondotia menciana Moore; DNA Extraction; CTAB Method; Protein Enzyme K Method; Salting-out Method

0 ?引言

桑蟥（Rondotia menciana Moore）是桑樹芽葉的重要害蟲之一。鱗翅目、蠶蛾科，別名桑蠶、白蠶、白蟥、松花蠶等。桑蟥分布于安徽、江蘇、浙江、山東、河南、河北、山西、陜西、甘肅、湖南、湖北、江西、四川、廣東及東北各省。寄主主要為桑樹，被侵害的桑樹滿葉蟲孔，蟥繭累累，葉黃如麻，嚴重影響秋蠶生產，是重要的國際性檢疫害蟲。

隨著分子生物學技術的飛速發展，從DNA水平對昆蟲進行物種分類鑒定、遺傳多樣性分析、探討系統發育、進一步研究物種起源與進化已成為現代昆蟲分子系統學和系統發育學的研究熱點[1]。而獲得高質量的基因組DNA是分子生物學實驗的基本需要，是進行分子標記、基因克隆及基因表達研究等下游技術的必要前提。因此尋求簡便、快速、有效的DNA提取方法，對于進一步開展分子生物學研究具有十分重要的意義[2]。

劉波等[3]用CTAB法成功提取了稻蝗昆蟲的干標本和酒精浸泡標本DNA。榮萬韜等[4]用蛋白酶K法對單條線蟲的基因組進行提取，探尋到一種高效穩定的DNA提取方法。張拓等[5]用比較了4種大豆蚜基因組DNA提取方法，結果證明鹽析法能夠更快速有效的提取大豆蚜基因組DNA。目前，對于昆蟲基因組DNA提取研究較少，僅限于雙翅目、直翅目中的一些昆蟲[6]，關于鱗翅目昆蟲基因組DNA提取的研究國內外鮮有報道。筆者采用3種昆蟲基因組DNA提取的常用方法，即CTAB法、蛋白酶K法和鹽析法稍作改進，以桑蟥為研究材料，通過基因組DNA OD260/280值、瓊脂糖凝膠電泳檢測，比較了3種方法提取的基因組DNA的質量，旨在為進一步深入開展其親緣關系分析、基因組比較、遺傳多態性和某些特定基因的標記等分子生物學研究提供一定的基礎資料。

1 ?材料與方法

選用3種不同方法從桑蟥幼蟲中提取基因組DNA，并經瓊脂糖凝膠電泳和PCR擴增產物電泳來檢測提取的DNA的純度和濃度。

1.1 ?材料

桑蟥，2013—2014年間采集于安徽省農業科學院蠶桑研究所的桑園內，經專家鑒定后用95%乙醇浸泡，放置于-20℃冰箱中保存。

1.2 ?桑蟥基因組DNA抽提方法

1.2.1 ?CTAB法 ?參照劉佳妮等[7]的方法，稍加改進。

（1）將單頭桑蟥幼蟲置于1.5 mL離心管中，加入400 ?L 2% CTAB提取緩沖液（0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0），0.02 mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2% CTAB）， ? ?-20℃放置10 min。充分研磨， 勻漿;（2）65℃水浴2 h，其間輕輕混勻2次，4℃ 10000 r/min離心15 min;（3）取上清液，加入等體積的氯仿：異戊醇（24：1）抽提，混勻，10000 r/min離心10 min，取上清，反復抽提2次;（4）75%乙醇漂洗沉淀2次，無水乙醇漂洗，室溫干燥，使乙醇揮發干凈。（5）加入30 μL滅菌ddH2O，充分溶解后于-20℃保存備用。

1.2.2 ?蛋白酶K法 ?參照其他的昆蟲提取方法[8-9]加以優化改進。

（l）取單頭昆蟲放在1.5 mL離心管中，加入100 ?L DNA裂解液（100 mmol Tris-HCL （pH 8.0），25 mmol EDTA （pH 8.0），500 mmol NaCL，1% SDS）。研磨，用400 ?L裂解液沖洗研磨棒。（2）加入蛋白酶K至終濃度100 ?L/mL，45℃水浴1 h，加入RNase A至終濃度20 ?L/mL，水浴15 min。（3）等體積苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）、氯仿：異戊醇（24：1）分別抽提一次，14000 r/min離心10 min。（4）取上清，加入2.5倍體積無水乙醇，14000 r/min離心10 min。（5）75%乙醇漂洗沉淀2次，無水乙醇漂洗，室溫干燥，使乙醇揮發干凈。（6）加入30 μL滅菌ddH2O，充分溶解后于-20℃保存備用。

1.2.3 ?鹽析法 ?參照Sunnucks等[10]的方法，稍加改進。

（1）將單頭桑蟥幼蟲置于1.5 mL離心管中，加入20 μL DNA提取緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，400 mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，1% SDS）研磨。（2）加入200 μL DNA提取緩沖液和6 μL蛋白酶K（20 mg/mL），充分混勻，置于60℃水浴1 h，中間取出混勻 ?2次。（3）加入80 μL 5 mol/L NaCl，充分振蕩15 s，4℃ 10000 r/min離心15 min，沉淀蛋白質，取上清液于另一離心管中。（4）加入2倍體積的冰凍無水乙醇，上下顛倒5次，至溶液徹底混勻，-20℃放置1 h。（5）4℃ 14000 r/min離心10 min，棄上清液。（6）加入300 μL預冷的75%乙醇，4℃ 10000 r/min離心15 min;將管口向下讓DNA自然干燥。（7）加入30 μL滅菌ddH2O，充分溶解后于-20℃保存備用。

1.3 ?濃度和純度的檢測

1.3.1 ?瓊脂糖凝膠電泳 ?采用穩壓穩流電泳儀（DYY-Ⅲ2型）和STS型紫外透射分析儀。其中瓊脂糖的濃度為1.0%，電壓為100 V，電泳時間為40 min。

1.3.2 ?紫外分光光度計檢測 ?采用日本分光株式Jasco公司（V-560型）的紫外分光光度計分別測定這3種方法提取的基因組DNA在260、280 nm處的吸收值，并根據OD260/280計算其純度。產量計算公式為[dsDNA]=50×OD260×稀釋的倍數。

1.3.3 ?PCR ?擴增比較不同的模板DNA ?PCR擴增引物采用Chris Simon等[11]發表的昆蟲蛋白質編碼細胞色素C氧化酶亞基I（COI）基因通用引物，上游引物C1-J-1718：5'-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC-3'和下游引物C1-N-2191：5'-CCCGGTAAAATTAAAATAT AAACTTC-3'。引物由寶生物（大連）工程有限公司合成。PCR擴增反應在Thermo Hybaid PCR儀上進行。PCR的反應體系為50 μL。內含10×反應緩沖液， ? ?2.5 mmol/L dNTP，25 mmol/L Mg2+，上下游引物各為20 pmol/μL，5 U/μL Taq酶，DNA模板50 ng，擴增條件為：95℃預變性5 min;循環周期依次為94℃變性40 s，47℃退火40 s，72℃延伸1 min;35個反應循環，72℃延伸10 min。為驗證PCR的可重復性和一致性，用同樣的反應體系和程序重復3次，至結果穩定。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

2 ?結果與分析

2.1 ?瓊脂糖凝膠電泳檢測

分別將3種方法提取的DNA在1%瓊脂糖上電泳，結果如圖1所示。3種方法都能成功提取到桑蟥基因組DNA（圖1）。

2.2 ?PCR擴增效果檢測

將3種方法所提DNA進行PCR擴增，產物進行瓊脂糖凝膠電泳，效果如圖2所示。3種方法抽提的DNA都能得到高效擴增，擴增效果無明顯差異。

2.3 ?3種提取方法比較

DNA純度的判斷根據OD260/280的比值判斷，符合要求純度高的DNA其OD260/280≈1.8。若OD260/280<1.6，說明樣品中存在蛋白質，應再用氯仿/異戊醇抽提，以乙醇沉淀純化DNA;若OD260/280>1.9，說明DNA中含有RNA，可考慮用RNA酶處理樣品[12]。本實驗中蛋白酶K法和CTAB法電泳檢測點樣孔干凈，主帶清晰整齊，無拖尾現象，DNA獲得率都在50 ng/μL以上，PCR擴增效果較好。提取的DNA樣品在OD260/280的吸光值均在1.6～1.9之間，說明得到的DNA比較純凈，蛋白質、多糖及酚類雜質去除的比較完全;飽和NaCl法提取的DNA電泳后條帶不太規整，有明顯的降解，說明提取的DNA不太純凈，樣品OD260/280都小于1.6，說明提取的DNA可能夾雜著蛋白質、多糖等雜質，純度不高。

3 ?結論與討論

DNA提取是分子生物學實驗的基礎，制備完整的、純度高的核酸是進一步試驗的關鍵因素。所以，總DNA的提取作為起始步驟是分子生物學技術的基礎和前提。但是昆蟲種類繁多、形態結構千差萬別，不同生物的基因組DNA需要采取不同的提取方法，但主要的步驟都包括破膜釋放DNA、抑制核酸酶和除去蛋白質與其他大分子等。在核酸提取的過程中仍存在著很多困難，如DNA含量相對較少，分離難度大，易被降解等。由于昆蟲個體較小，其核酸含量就更少，提取工作更加困難，因此，選取適合的DNA提取方法至關重要[13-14]。

本實驗比較分析了3種桑蟥基因組DNA提取方法，利用CTAB法提取桑蟥DNA，整個實驗過程耗時短，不需要昂貴的儀器設備和實驗藥品，易于在一般的實驗室里完成整個操作。而蛋白酶K法相對于CTAB法，所需試劑價格較昂貴，成本較高。在實驗時間充裕的情況下，可以從這2種方法中選擇;鹽析法操作簡單連貫，不使用苯酚、氯仿、異戊醇等有毒試劑，但是降解較嚴重，產率較低，純度較差，3種方法提取的DNA均可用于PCR擴增。因此可以根據不同的實驗條件選擇使用。

根據已發表的相關文獻，已有很多提取昆蟲DNA的方法，但是至今未發現一種通用的方法[15]，不同生物DNA的提取方法不盡相同，但各種提取方法也有很多相通之處，可以相互借鑒。當然隨著分子生物學的快速發展，各種簡潔、高效的DNA提取方法也會不斷的創新出現，相信這些方法在不斷的優化后可以更好地應用于鱗翅目昆蟲的基因提取實驗[16]。

參考文獻

[1] 陳學新.昆蟲分子系統學和進化[A].昆蟲分子生物學[M].北京：科學出版社，2001.

[2] 石晶，謝映平，薛皎亮，等.蟻蟲基因組DNA不同提取方法的比較[J].昆蟲知識，2005，42（2）：207-211.

[3] 劉波，鄭哲民，張迎春，等.稻蝗屬基因組 DNA提取方法[J].陜西師范大學學報，自然科學版，1999，27（3）：97-99.

[4] 榮萬韜，王金成，劉鵬，等.單條線蟲DNA提取方法研究[J].華北農學報，2014，29（2）：127-132.

[5] 張拓，龐春杰，韓嵐嵐，等.大豆蚜基因組DNA四種提取方法的比較[J].大豆科學，2013，32（4）：473-476.

[6] 魏方超，楊茂發，彭瑤，等.稻水象甲AFLP分析中基因組DNA提取方法的研究，2012，40（9）：129-132.

[7] 劉佳妮，桂富榮，李正躍，等.稻飛虱基因組DNA提取方法的比較[J].云南農業大學學報，2009，24（1）：37-41.

[8] 田英芳，黃剛，鄭哲民，等.一種簡易的昆蟲基因組DNA提取方法[J].陜西師范大學學報：自然科學版，1999，27（4）：82-84.

[9] Cooper J B， Hewitt G M. Nuclear DNA sequence divergence between parapatric subspecies of the grasshopper Chorhthippus parallelus[J]. Insect Mol Biol，1993，2（3）：185-194.

[10] Sunnucks P， Hales D F. Numerous transposed sequences of mitochondrial cytochrome oxidase I-II in Aphids of the genus Sitobion （Hemiptera： Aphididae）[J]. Molecular Biologyand Evolution，1996，13（3）：510-524.

[11] Simon C， Frati F， Beckenback A， et al. Evolution， weighting， and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved chain reaction primers[J]. Annms of the Entomological of America，1994，87（6）：651-701.

[12] 代金霞，于有志，鄭哲民.擬步甲科昆蟲基因組DNA提取的比較研究[J].寧夏大學學報：自然科學版，2004，25（1）：66-68.

[13] 武強，呂志創，萬方浩，等.三種提取蘋果綿蚜基因組DNA方法的比較[J].生物技術通報，2012（1）：70-73.

[14] 王永模.微衛星標記技術對麥長管蚜的生殖模式與遷飛規律研究[D].北京：中國農業大學，2007.

[15] 胡澤章，黃建，王竹紅.昆蟲標本DNA提取的研究進展[J] .武夷科學，2013，29（1）：165-170.

[16] Muirhead K A， Murphy N P， Sallam N， et al. Phylogenetics and genetic diversity of the Cotesia flavipes complex of parasitoid wasps （Hymenoptera： Braconidae）， biological control agents of lepidopteran stemborers[J]. Mol Phylogenet Evol，2012，63（3）：904-914.