山東灰霉病菌對腐霉利的抗藥性檢測

劉超 張悅麗 張博 李長松 石磊 齊軍山

摘 ?要：為監測灰霉病菌對腐霉利的抗藥性，2012年12月到2013年5月，在山東省內10個市縣，采集灰霉病菌樣本150余份，分離得到灰葡萄孢（Botrytis cinerea）菌株130株，采用生長速率法對130株灰霉病菌進行抗藥性檢測。結果表明，腐霉利對灰霉病菌的EC50的范圍為0.1208～12.486 ?g/mL，平均EC50為4.03 ?g/mL，抗性頻率達到67.69%。其中低抗菌株占52.38%，中抗菌株占19.048%，未檢測到高抗菌株。本研究可為灰霉病的防治特別是殺菌劑的輪換使用提供依據。

關鍵詞：灰葡萄孢;殺菌劑;腐霉利;抗藥性

中圖分類號：S482.2 ? ?文獻標志碼：A ? ?論文編號：2014-0213

Resistance Detection for Botrytis cinerea Against Procymidone in Shandong Province

Liu Chao1，2， Zhang Yueli2， Zhang Bo2， Li Changsong2， Shi Lei1， Qi Junshan2

（1School of Life Science， Qufu Normal University， Qufu 273165， Shandong， China;

2Institute of Plant Protection， Shandong Academy of Agricultural Sciences/

Shandong Province Key Laboratory of Plant Virology， Jinan 250100， Shandong， China）

Abstract： In order to monitor procymidone resistance of Botrytis cinerea， from December of 2012 to May of 2013， many Botrytis cinerea samples were collected from 10 cities in Shandong， and 130 isolates were purified from them. The resistances of Botrytis cinerea were determined in 130 isolates by measuring the mycelia growth on the fungicide-amended media. The means of the 50% effective concentration values （EC50） were 4.03 ?g/mL. The resistance frequency was 67.69%， 52.38% of Botrytis cinerea was low resistant strains， 19.048% of Botrytis cinerea was moderate resistant strains; there was no high resistant strain. The results provided a theoretical basis for using fungicides efficiently to prevent and control botrytis cinerea in the field.

Key words： Botrytis cinerea; Fungicides; Procymidone; Resistance

0 ?引言

灰霉病是危害最嚴重、分布最廣泛的植物病害之一，其病原灰葡萄孢（Botrytis cinerea），于2012年被《Molecular Plant Pathology》雜志評為最重要的十大植物病原真菌中的第2位。可侵染番茄、草莓、梨、黃瓜、西葫蘆、蕓豆、萵苣、辣椒、獼猴桃、葡萄以及核桃甚至小麥等數百種作物[1-5]。據黑龍江農科院的王春艷[6]報道，1988年黑龍江省綏化地區大面積爆發灰霉病，損失高達38%～42%，發病面積占生產面積的80%以上，造成了嚴重的經濟損失。

灰霉病菌繁殖快、易變異，其防治難點在于極易產生抗藥性。國內外對灰霉病抗藥性有不少的報道，1992年劉波等[7]發現某些地區的灰霉菌株對腐霉利有一定的抗藥性，并得出苯并咪唑類和二甲酰亞胺類的抗藥性二者不存在交互抗性的結論。1997年，李林等[8]在對282株灰霉菌株的研究中，發現多菌靈的抗性菌株已經達到了81.9%，而對腐霉利已經產生抗性，大多數菌株處于低抗水平。2001年，丁中等[9]在山東3個保護地的采樣結果表明，多菌靈與腐霉利的雙抗菌株的頻率達到100%。病菌的抗藥性監測是一項日常性又極為重要的工作，雖然已經有不少類似的研究，但是不同地區的病菌抗藥性不同。即便同一地區，隨著時間的發展，病菌的抗藥性也會發生變化。本研究的目的是對當前山東地區灰霉病菌對腐霉利抗藥性進行檢測，為田間用藥以及灰霉病的防治提供理論依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?灰霉菌株的采集與分離

2012年12月—2013年5月，在山東省內10個城市的多個區縣保護地，以大棚為單位進行灰霉病果和病葉的采集，每個大棚采集2～4個病果或者病葉。將樣品包好帶回實驗室，分離純化，獲得灰霉菌株。

1.2 ?供試藥劑

98.4%腐霉利原藥（如東縣華盛化工有限公司）。

1.3 ?供試含藥培養基

98.4%腐霉利原藥用丙酮配制成10000 μg/mL的母液，且以0.2%的量加入乳化劑Tween-80。將母液置于4℃冰箱內貯存，將其稀釋到合適的濃度使用。

1.4 ?抗藥頻率的測定

本實驗采用最低抑制法（MIC），以Yarden[10]標準為基準，如果能在5 μg/mL腐霉利PDA含藥平板上生長的菌株為抗性菌株。

將待測菌株在21℃的恒溫培養箱中培養3天，用5 mm的打孔器在菌落的邊緣打孔，將菌柄移至帶藥平板中央，培養5天，觀察結果，統計菌株的抗性頻率。

1.5 ?抗性水平的測定

采用生長速率法，將抗性和敏感菌株分別在含有腐霉利梯度平板上進行毒力測定，重復3次，待4～5天，對照長滿平板時，采用十字交叉法量取菌落直徑，計算抑制率。利用DPS統計軟件，計算菌株的EC50，得到菌株的抗性水平。

抗性菌株=[抗性菌株EC50敏感菌株EC50]

根據抗性水平，可將灰霉菌株分為3種抗性類型[11]，如果抗性菌株的EC50與敏感菌株的EC50的比值小于10時，則為低抗型，如果在11～100倍之間時，則為中抗型，如果大于100倍時，則為高抗型。

2 ?結果與分析

2.1 ?灰霉病原菌的分離和基本特征

將采集到的灰霉病樣品，室內分離并得到Botrytis cinerea菌株130株，經觀察發現，灰葡萄孢菌落初為白色，產孢后菌絲聚集呈褐色;分生孢子梗數根叢生，具隔，褐色，頂端具有分枝，梗頂稍膨大，呈棒頭狀，其上密生小柄并有大量分生孢子。灰葡萄孢菌在平板上的形態如圖1。

2.2 ?灰霉病菌對腐霉利抗性頻率測定

以5 μg/mL為抗感標準，灰霉菌株對腐霉利敏感菌株42株，抗性菌株88株，抗性頻率為67.69%。通過對不同地區的抗性頻率的統計（如圖2）發現，棗莊地區對5 μg/mL腐霉利的抗性頻率達到93.33%，而聊城地區的抗性頻率為0%，由此可見，各地區對腐霉利的抗性頻率是不盡相同的。

2.3 ?灰霉菌株對腐霉利抗性水平測定

在分離得到的130株中，根據地區分布選取21株進行抗藥性測定，EC50的范圍為0.1208～12.486 ?g/mL，平均EC50為4.03 ?g/mL，根據抗性頻數分布圖（圖3）可以得知，大部分的EC50分布在1～5 ?g/mL，其中敏感菌株為28.571%，低抗菌株為52.38%，中抗菌株為19.048%，沒有高抗菌株。

3 ?結論與討論

二甲酰亞胺類殺菌劑腐霉利，在20世紀70年代曾被認為是苯并咪唑類藥物的最佳替代品。早在1971年Bollen和Scholten[12]就已經發現了苯并咪唑類的抗藥性菌株，而二甲酰亞胺抗藥性菌株的發現大多集中在八九十年代。1992年Moorman和Lease[13]調查了13個賓夕法尼亞州的種植園，發現苯并咪唑類和二甲酰亞胺類的抗藥性菌株，并且發現雙抗菌株，1996～1997年，Yourman和Jeffers[14]從35個保護地325株灰霉菌株中，發現69%的菌株對二甲酰亞胺類農藥乙烯菌核利有抗藥性，而對苯并咪唑類和二甲酰亞胺類的雙重抗藥性菌株達67%。根據1997年英國人LaMondia和Douglas[15]報道，45株灰霉菌中有43%對二甲酰亞胺類農藥乙烯菌核利存在抗藥性。這說明，自20世紀90年代以來，二甲酰亞胺類殺菌劑的抗藥性問題越來越突出。

本實驗室自20世紀90年代開始監測灰霉病菌的抗藥性，1997年曾對腐霉利的抗藥性進行過報道[8]，結果發現EC50值在1.1598～4.5631之間，全部為低水平抗性菌株，未檢測到高水平抗性菌株。本次檢測結果EC50有66.67%分布在1～6 ?g/mL之間，其中低抗菌株為52.38%、中抗菌株為19.048%，沒有高抗菌株。與十幾年前的檢測結果相比，經過10余年的用藥，其EC50的范圍波動不大，但是抗性頻率、抗性水平明顯提高。結果中聊城地區灰霉菌株抗藥性頻率為0%，可能與采樣范圍及其代表性有關。抗藥性的產生，主要是因為種植者在一個生長季節內持續使用同一種殺菌劑，使病菌面臨強大的選擇壓力產生抗性菌株。近年來由于乙霉威、嘧霉胺、嘧菌環胺等不同類型殺菌劑的交替使用，延緩了腐霉利抗藥性的大面積發生。生產上，應該綜合應用農業措施、生態治理、生物防治以及輪換使用不同類型的化學殺菌劑來防治灰霉病，避免連續使用單一的化學殺菌劑以免病菌產生抗藥性導致防治失敗。

參考文獻

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