裸花紫珠組培快繁技術研究

2014-04-29 11:55:07黃東梅林妃許奕李羽佳李艷霞馬蔚紅李敬陽

農學學報 2014年12期

黃東梅林妃許奕李羽佳李艷霞馬蔚紅李敬陽

摘 ?要：以裸花紫珠無菌苗幼嫩莖段為外植體，研究不同激素配比下芽誘導、增殖和生根情況，獲得一套裸花紫珠快速繁殖的方法。結果表明：裸花紫珠幼嫩莖段誘導不定芽的最適培養基為MS+ 6-BA ? ? ?2.0 mg/L+ NAA 0.1～0.3 mg/L;不定芽在添加6-BA和NAA的各處理上均可增殖，在MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.3 mg/L上增殖系數最高、芽苗健壯;最佳生根誘導培養基為1/2MS+ NAA 0.05 mg/L+ IBA 0.5 mg/L。此方法可為裸花紫珠快繁提供技術支持。

關鍵詞：裸花紫珠;組織培養;快繁

中圖分類號：S567 ? ?文獻標志碼：A ? ?論文編號：2014-0577

Study on Fast Propagation via Tissue Culture for Callicarpa nudiflora

Huang Dongmei1， Lin Fei1， Xu Yi1， Li Yujia1， Li Yanxia1， Ma Weihong1，2， Li Jingyang1，2

（1Hainan Key Laboratory of Banana Genetic Improvement， Haikou Experimental Station/

Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou 570102， Hainan， China;

2Seedlings Cultivation Center， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou 571737， Hainan， China）

Abstract： Using youngest stem of Callicarpa nudiflora as explant， the effects of different kinds and concentrations of plant grows regulator on shoot induction， proliferation and rooting were studied in order to get a unit of technology on fast propagation. Result showed that adventitious buds could be fast induced on medium MS+ 6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.1-0.3 mg/L， and the optimum proliferation medium was MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.3 mg/L+ GA3 0.5 mg/L， on which could get the highest proliferation rate and strongest shoots. Root could be induced best on medium 1/2MS+ NAA 0.05 mg/L+ IBA 0.5 mg/L. This method could provide technical support for large-scale propagation of Callicarpa nudiflora.

Key words： Callicarpa nudiflora Hook. Et Arn; Tissue Culture; Fast Propagation

0 ?引言

裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook. Et Arn），為馬鞭草科植物，是一種藥用、觀賞綠化兼用植物，植株高3～4 m，為灌木至小喬木，植株全株可入藥，味苦微辛性平，具有消炎、解毒、收斂、止血的功效[1]。裸花紫珠是海南省的主要道地藥材，備受重視，是海南省正致力于大力發展的南藥品種之一，已建成的國家中藥現代科技產業（海南）基地建設規劃中亦有提及裸花紫珠[2]，以裸花紫珠為原料制成裸花紫珠膠囊、裸花紫珠片等已在市場上銷售。

目前，國內外學者們對裸花紫珠的研究主要集中在對其化學成分分析、療效的觀察和鑒定、藥劑制備等方面[3-4]，對其繁殖和增殖快繁研究較少[5]，目前市場對裸花紫珠的需求增大，而供給大部分依賴野生資源[7]，過度采用易使資源枯竭，因此很有必要加快對裸花紫珠繁育技術的研究。裸花紫珠傳統繁育中存在種籽結實率低、分株繁育和扦插繁育增殖系數小等問題[7-8]，宜積極研究其他再生技術如現代的組織培養等方法來擴大裸花紫珠繁殖的規模[9]。在本研究起步時，尚無關于裸花紫珠組織培養的文獻報道，本研究參考同科屬其他物種，設計不同培養基配方，對裸花紫珠芽誘導、芽增殖及生根誘導等進行了優化研究，以期獲得適宜裸花紫珠組織培養的條件，為通過組培快繁實現裸花紫珠的人工快速繁殖提供技術基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗時間、地點

研究田間試驗于2012—2013年在熱作兩院種苗組培中心進行，室內試驗在中國熱帶農業科學院海口實驗站熱帶種苗繁育中心進行。

1.2 ?試驗材料

選取裸花紫珠無菌苗的幼嫩莖段作為外植體，裸花紫珠無菌苗由熱作兩院種苗組培中心提供。

1.3 ?試驗方法

1.3.1 ?不定芽誘導 ?在超凈工作臺上，選取長勢良好、莖粗壯的枝條，小心切去頂芽、葉片，將莖切成1～2 cm的帶節小段，接種于附加不同濃度6-BA（0.5、1.0、1.5、 ? 2.0 mg/L）及NAA（0.1、0.3、0.5 mg/L）的MS培養基（白砂糖30 g/L，卡拉膠8 g/L，pH 5.8，下同）上，每個處理接種3瓶，每瓶5個外植體。培養溫度（25±2）℃，光周期16 h /8 h（光/暗培養），下同。觀察并記錄外植體出芽情況，篩選最佳不定芽誘導培養基。

1.3.2 ?增殖培養 ?將誘導出的叢生芽分成大小相近的一小簇（約含3～5個小芽），轉至含有不同濃度的6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）和NAA（0.1、0.3 mg/L）的MS培養基上進行增殖壯苗培養，每個處理接種5瓶，每瓶3簇叢生芽。觀察并記錄芽生長增殖情況，篩選最佳增殖培養基。

1.3.3 ?生根培養 ?不定芽經過增殖壯苗長至2～3 cm后，將芽切下，轉至添加NAA（0.05、0.1 mg/L）和/或IBA（0.1、0.5、1.0 mg/L）的1/2MS培養基中進行生根誘導，每個處理接種5瓶，每瓶接4株，觀察并統計生根情況，篩選最佳生根培養基。

1.3.4 ?煉苗移栽 ?待組培苗健壯、根系發達、根長約4～5 cm后，將培養瓶打開瓶蓋，放置于溫室煉苗1周左右，取出生根苗用自來水清洗去掉根系上所粘附的培養基，栽入含有50%椰糠的基質中，用保鮮膜覆蓋，每天定期噴水保濕，約1周后去掉保鮮膜進行正常栽培管理。

2 ?結果與分析

2.1 ?不定芽的誘導

將裸花紫珠幼嫩莖段接種至12種芽誘導培養基上，約20天后開始有新芽從節點長出，40天后出芽數劇增，統計各處理的出芽數并進行顯著性比較（表1）。從結果可以看出，裸花紫珠幼嫩莖段在不同培養基上芽誘導率有所差異，且各處理組誘導率都在80%或以上，表明在MS培養基中添加適量的6-BA和NAA可以較好地誘導裸花紫出芽，激素濃度與芽的誘導率密切相關，其中在10號和11號培養基上，即MS+ 6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.1～0.3 mg/L上芽誘導率最高，誘導率100%，為裸花紫珠莖段最佳芽誘導培養基。

2.2 ?芽的增殖及壯苗

將叢生芽切割成大小近似的小塊，每塊約含有3～5個小芽，轉接至增殖培養基，切割時注意將粘連的愈傷組織、枯死的葉片及不正常芽等切除掉以免影響生長繼而影響統計結果，約30天后可統計增殖情況，結果如表2所示，從結果可以看出，叢生芽在各處理的增殖培養基均能分化出不定芽，增殖系數大都在5～8以上，表明在基本培養基中添加6-BA和NAA能促進不定芽的增殖和分化。各處理的增殖系數和效果有差異，存在出芽快慢、長短、葉好壞之分，具體如圖1所示。通過數據統計及觀察比較結果，4、5、6號培養基的增殖系數最高，不定芽幾乎鋪滿整個培養瓶，又以6號培養基的不定芽生長狀況最好，為最佳的增殖苗態，根據結果篩選出最佳增殖培養基為6號（MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.3 mg/L），在此培養基上裸花紫珠增殖系數高、芽粗壯、植株健壯。

2.3 ?生根及移栽

將不定芽接到11種生根培養基中進行生根誘導，培養10天左右芽基部開始出現萌動，15～20天左右開始有根長出，30天后根系基本上能達到4～5 cm。不同處理的根系生長情況如表3所示。不定芽在添加有NAA、IBA及2種組合的培養基上均能誘導生根，生根誘導率100%，表明低濃度的NAA和IBA均能促進生根。但不同的培養基生根情況有差別，如處理1、2、3、4、6、11等處理誘導的根系較少，而處理5、7的根系則很旺盛;處理3、4、5處理誘導的根屬于細長型，對營養的吸收稍弱，植株亦較瘦弱，處理1、2、7、9、10等的根系則很粗，植株亦更粗壯，而處理12的根系雖然粗，但是有膨大的海綿體類組織，反而影響植株對營養的吸收繼而影響植株生長。根據觀察和統計結果，以 ? ? ? 1/2MS+ NAA 0.05 mg/L+ IBA 0.5 mg/L培養基上生根最好，根系生長快且粗壯旺盛，植株健壯，為最佳生根培養基。裸花紫珠組培苗經過煉苗和移栽后，在基質上成活率可達90%以上。

3 ?結論

迄今為止，裸花紫珠離體快繁技術在國外未見報道，國內僅有潘梅等[10]1篇報道。本研究與該研究的目標均為通過組織培養獲得裸花紫珠快速繁殖的方法，差別在于選用的外植體不一致。本研究的優勢在于：（1）不需要經過種子消毒發芽等過程，操作簡單;（2）通過莖段即可誘導出芽，而1棵植株可切分為多個莖段，相較種子繁殖系數更高。

選用基本培養基MS添加適量的6-BA和NAA可較好地誘導裸花紫珠幼嫩莖段產生不定芽，約20天即開始萌動產生芽點;40天可產生叢生芽;誘導率在80%以上，最適培養基為MS+ 6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.1～0.3 mg/L;不定芽在添加一定濃度的6-BA和NAA的MS基本培養基上均可增殖，30天后繁殖系數最高可達9以上，在培養基MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ NAA ? ?0.3 mg/L上增殖系數最高、芽苗健壯;最佳生根誘導培養基為1/2MS+ NAA 0.05 mg/L+ IBA 0.5 mg/L，生根誘導率100%。

4 ?討論

在植物的組織培養過程中，生長調節劑的種類和濃度是影響外植體誘導分化愈傷組織、不定芽、不定根的主要影響因子。筆者選用6-BA和NAA誘導裸花紫珠莖段產生不定芽，誘導率高達100%。觀察結果發現在同一6-BA濃度下隨著NAA的濃度提高出芽率呈一定的上升趨勢，但濃度過高出芽率又降低，表明低濃度的生長素對出芽有促進作用，而高濃度的生長素反而抑制出芽;在同一NAA濃度下隨著6-BA濃度的上升出芽率也逐漸提升，表明6-BA越高越有利于細胞分化增殖，但也不是越高越好，尤其在增殖壯苗培養中高濃度的6-BA會引起不定芽葉片、莖和嫩梢膨大呈高度透明或半透明水浸狀，此即植株組織培養的玻璃化，當不定芽呈現玻璃化，就很難繼續增殖和生長。

在本研究中，不定芽最佳誘導培養基為MS+ 6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.1～0.3 mg/L，最佳增殖培養基為MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.3 mg/L，兩者的差別在6-BA濃度不一致，表明植物在組織培養的不同階段對細胞分裂素的要求不同，在某些特定階段可耐受較高的濃度并且需要較高濃度的細胞分裂素來促進其分化生長，而在其他階段的培養中則不一定需要。

馬鞭草科植物組織培養中最常用的促進不定芽生根的激素為NAA和IBA等[11-12]，筆者研究認為NAA和IBA組合的培養基較單獨的NAA或IBA誘導生根更好，與李寬中等[13]研究結果一致;IBA濃度不是越高越好，高濃度的IBA對生根反而不利，猜測可能和IBA與一些酶互作影響酶活性進而影響生根和伸長有關[14]，李麗淑等[15]研究同樣發現高濃度IBA對生根反而起抑制作用;此外，NAA的濃度也不能過高，NAA屬于效果比較強的生長素，低濃度時可以促進生根，過高濃度容易使根系膨大成海綿根，不利于植物吸收營養，最終導致成活率低下，此結果與潘梅等[10]研究結果一致。

隨著市場對裸花紫珠的需求增高，對裸花紫珠繁殖等的研究亦會更熱門，本研究結果可為裸花紫珠快繁提供一定的技術支持。

參考文獻

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