人用狂犬病疫苗中β—丙內酯殘留量的檢測

劉輝等

【摘 要】 目的：檢測人用狂犬病疫苗中BPL的殘留量。方法：采用氣相色譜法檢測BPL含量，確定最低檢出限，并分析BPL在37℃條件下的水解變化情況，檢測人用狂犬病疫苗中的β-丙內酯的殘留量。結果：氣相色譜法檢測BPL含量的靈敏度為8.96ppm，對人用狂犬病疫苗中的β-丙內酯進行檢測，未發現殘留。結論：氣相色譜法檢測BPL殘留量的靈敏度較高，結果可靠，可用于人用狂犬病疫苗生產過程中BPL殘留量的檢測。

【關鍵詞】 β-丙內酯（BPL） 氣相色譜法 人用狂犬病疫苗

【中圖分類號】 R446.1 【文獻標識碼】 A 【文章編號】 1671-8801（2014）03-0326-02

β-丙內酯（β-Propiolactone，BPL）又名羥基丙酸內酯，是一種雜環類化合物 （C3H4O2），沸點155℃，常溫下為無色黏稠狀有刺激氣味的液體，對病毒具有很強的滅活作用，其滅活機制是作用于核酸，改變其結構以達到滅活目的，在不破壞病毒抗原的同時，又能保持病毒良好的免疫原性；BPL水解后為無毒性的人體脂肪代謝產物β-羥基丙酸，常用于病毒類疫苗特別是人用狂犬病疫苗的滅活。

但BPL是一種致癌物，對皮膚、黏膜及眼睛有刺激性，因此必須對疫苗中的BPL含量進行檢測，確保其已被完全水解，保證疫苗的安全性。本文采用氣相色譜法檢測了BPL的殘留量，并對人用狂犬病疫苗中是否有BPL殘留進行了檢測，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

Agilent 公司7890A氣相色譜儀。

1.1.2 試劑

β-丙內酯，購自德國SERVA，濃度1.146 g/ml。

PBS緩沖液（pH7.6）；人用狂犬病疫苗原液（以β-丙內酯滅活，批號T-RB20130101，T-RB20130102，T-RB2013003），由成都生物制品研究所有限責任公司病毒性疫苗研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 氣相色譜法分析條件

毛細管色譜柱為Agilent DB-624；載氣為氮氣，流速5ml /min；氣化室溫度180℃；檢測器溫度250℃；柱溫120℃；進樣量0.5μl。

1.2.2 繪制標準曲線

BPL用PBS緩沖液（pH7.6）作1：1000、1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000、1：128000、1：256000、1：512000稀釋，分別進樣，進行氣相色譜法測定。以BPL含量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，同時以PBS緩沖液（pH7.6）作空白對照。

1.2.3 BPL重復性檢測情況

BPL用PBS緩沖液（pH7.6）作1：4000稀釋，進樣6次，進行氣相色譜法測定，考察BPL重復性檢測情況。

1.2.4 BPL水解變化情況

BPL用PBS緩沖液（pH7.6）作1：4000稀釋，37℃水浴水解，每隔30min抽樣進行氣相色譜法測定，檢測BPL含量。

1.2.5 人用狂犬病疫苗原液中BPL水解情況檢測

1.3 批人用狂犬病疫苗原液按1：4000比例加入BPL滅活，37℃水浴水解2h，抽樣進行氣相色譜法測定，檢測BPL含量。

2 結果

2.1 標準曲線繪制

隨著BPL稀釋倍數的增加，色譜峰面積隨之減小，當BPL稀釋至1：512000

時，未檢測出峰，結果見表1。空白對照無色譜峰出現。

根據1：128000稀釋時的信噪比為2.9，確定本方法的最低檢出限為8.96ppm，根據表1，以BPL含量為橫坐標，峰面積為縱坐標作標準曲線，發現峰面積與BPL 含量呈線性關系，Y = 0.0741X + 1.9015，R2 = 0.997，標準曲線見圖1。

2.2 BPL重復性檢測情況

BPL用PBS緩沖液（pH7.6）作1：4000稀釋，進樣6次，進行氣相色譜法測定，BPL保留時間分別為：3.015min、3.018 min、3.016 min、3.011 min、3.009 min、3.011 min，RSD為0.12%；BPL峰面積分別為：25.9、25.5、25.3、26.1、24.9、25.7，RSD為1.68%；兩者均小于2%，表明用氣相色譜法檢測BPL殘留的重復性良好。BPL色譜圖見圖2。

2.3 BPL水解變化情況

BPL用PBS緩沖液（pH7.6）作1：4000稀釋，37℃水浴水解后進樣檢測，用標準曲線計算BPL含量。結果顯示，隨著水解時間的延長，BPL含量逐漸降低，水解3.0h后降至最低檢出限以下，見表2。

2.4 人用狂犬病疫苗原液中BPL水解情況

將3批人用狂犬病疫苗原液按1：4000比例加入BPL滅活后，37℃水浴水解2h，進行氣相色譜分析。根據結果1和2，BPL的出峰時間為3.015min左右，人用狂犬病疫苗原液在該時間點無峰出現，未檢測出BPL殘留，說明疫苗原液中BPL已完全水解。見圖3。

3 討論

隨著我國綜合國力和人民生活水平的提高，人們對于醫藥產品尤其是應用于健康人群的疫苗產品的安全要求也越來越高。目前，國內大部分疫苗生產企業都使用BPL滅活狂犬病毒，對于疫苗的安全性評估，雖然有動物試驗支持，但在生產過程中還應檢測BPL的含量，確保BPL完全水解。由于氣相色譜法檢測靈敏度高，樣品用量少，結果準確快速可靠，因此在生物學、醫學、藥物學、環境保護、臨床化學等領域，已廣泛應用于化學成分的定性定量分析。本文采用氣相色譜法檢測BPL的殘留量，最低檢測限可達到8.96ppm，用該方法檢測人用狂犬病疫苗中BPL的含量，結果3批疫苗原液在BPL出峰處均無色譜峰出現，表明在37℃水浴水解2h后，原液中BPL已完全水解，無殘留。該方法準確可靠，較好地解決了BPL殘留量檢測的問題，可用于狂犬病疫苗生產過程中BPL殘留量的檢測，確保疫苗的安全。

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作者簡介：劉輝，男， 1980年11月3日生，漢族，四川成都人?，F為四川大學生物治療國家重點實驗室2010級生物醫學工程專業工程碩士，研究方向為：疫苗的設計、制備及規?；a。

指導老師：葉琳，女，現為成都生物制品研究所有限責任公司研究員。