蒲公英多糖測定方法研究

劉嫻 何曉麗 王倩倩

摘 要：通過對蒲公英脫脂、除單糖和低聚糖、脫蛋白和精制，得蒲公英多糖精制品，再用蒽酮-硫酸法對蒲公英多糖含量進行測定，同時研究其重現性、穩定性及加樣回收率。

關鍵詞：蒲公英多糖；蒽酮-硫酸法；測定方法

糖類是人類能量的重要來源，分為單糖、雙糖和多糖。多糖是由十個以上醛糖或酮糖由糖苷鍵結合起來的糖鏈。多糖不僅能提供能量，也是組成生物體的重要物質。多糖具有很多生理活性，

如：排出毒素、抗衰老、增強免疫力、抗腫瘤、降血糖、抗輻射等，而且對正常細胞無毒副作用，有很高的研究價值。

多糖的檢測方法很多，目前尚無國家標準。多糖的測定可分為直接法和間接法。直接法是對多糖本身進行測定，例如：色譜法、光譜法、生物傳感器法和酶法等。該法分析數據精確，有效成分明確，但是操作步驟復雜，實驗成本高。間接法是利用多糖的還原性，或是利用酚類或胺類化合物與多糖脫水生成的糠醛發生縮合反應產生特定顏色的性質進行測定，例如：硫酸-蒽酮法、苯酚-硫酸法、3，5-二硝基水楊酸法和斐林試劑法等。間接法操作簡單、快速，不需要昂貴的儀器和特定的酶，因而被廣泛使用。

蒲公英是《藥典》收載的常用中藥之一，也是家喻戶曉的野生蔬菜，在我國分布非常廣泛。蒲公英富含多糖。文章用硫酸-蒽酮法對新鮮采摘的蒲公英多糖進行測定，研究測定結果的重現性、穩定性和回收率的影響，為后續的研究工作奠定基礎。

一、材料與方法

1.材料

蒲公英，學院苗圃園新鮮采摘。

2.試劑

蒽酮試劑：稱1 g蒽酮溶于50 mL乙酸乙酯，棕色瓶保存。

葡萄糖標準溶液：稱取105 ℃烘干至恒重的葡萄糖0.1000 g，用水定容至1000 mL。

3.儀器

分光光度計、離心機、干燥箱、粉碎機、索氏提取器、旋轉蒸發儀。

4.方法

（1）蒲公英多糖的提取

①蒲公英預處理：將新鮮采摘的蒲公英洗凈、烘干、粉碎，過100目篩。

②脫脂：將蒲公英粉末放入索氏提取器中，用石油醚（沸程40 ℃）回流脫脂3 h。

③除單糖和低聚糖：將脫脂蒲公英粉末用80%乙醇回流8 h，除去單糖和低聚糖。

④熱水浸提：把蒲公英處理物按1∶30的比例放入80 ℃熱水中浸提3 h，得蒲公英提取液。共提取2次。

⑤濃縮：用旋轉蒸發儀對蒲公英提取液進行濃縮。

⑥脫蛋白：用Sevag法除去蛋白質。

⑦醇析：向濃縮液中加入95%乙醇，使乙醇最終濃度為80%。靜置4 h進行醇析，4000 r/min離心5 min。沉淀物即為粗多糖。

⑧粗多糖的精制：將粗多糖溶于水，透析36 h，用80%乙醇沉淀多糖，4000 r/min離心5 min。沉淀物再分別用乙醇和丙酮各洗滌3次，干燥得精制多糖。

（2）制備蒲公英多糖樣液

準確稱取蒲公英精制多糖粉末0.0100 g，用水定容至1000 mL。

（3）蒲公英多糖含量測定

①繪制標準曲線

取7支25mL比色管，依次加入葡萄糖標準溶液0 mL，0.10 mL，0.20 mL，0.40 mL，0.60 mL，0.80 mL，1.00 mL，分別加水至2.0 mL，再分別加0.5 mL蒽酮試劑和5 mL濃硫酸，混勻，沸水浴加熱5 min，冷卻。以0號管為參比管，在620 nm波長下測定吸光值。以葡萄糖的含量為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。

②重現性試驗

準確吸取蒲公英多糖樣液2.0 mL于25 mL比色管，按①的方法加入試劑，測定其吸光值。作6個平行樣。

③穩定性試驗

準確吸取蒲公英多糖樣液2.0 mL于25 mL比色管，按照①的方法加入試劑，分別在顯色后10 min，20 min，30 min，1 h，1.5 h，

2 h測定其吸光值，從而求出多糖含量。

④測定回收率

準確吸取蒲公英多糖樣液1.0 mL于25 mL比色管，分別加入葡萄糖標準溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，加水至2 mL，按照①的方法加入試劑，測定其吸光值。計算加樣回收率。

二、結果與分析

1.繪制標準曲線

葡萄糖標準曲線見下圖。由下圖可以看出，當葡萄糖濃度在0～100 μg/mL時，葡萄糖的含量與吸光度呈良好的線性關系。

2.重現性試驗

根據測得的吸光值，計算得出蒲公英多糖的含量分別為

25.68 g/100 g，25.67 g/100 g，24.76 g/100 g，24.65 g/100 g，25.62 g/100 g，24.72 g/100 g，平均值為24.68 g/100 g，RSD=0.20%。實驗數據表明該方法的重現性良好。

3.穩定性試驗

在10 min，20 min，30 min，1 h，1.5 h，2 h后測定的吸光值分別為0.399，0.398，0.400，0.399，0.398，0.399，平均值為0.399，RSD=0.189%，表明蒲公英多糖的測定在

2h內基本穩定。

4.回收率試驗

由實驗測定的吸光值，計算加樣回收率，分別為99.38%，98.76%，

99.05%，99.28%，99.26%，98.35%，平均回收率為99.01%，RSD=

0.40%。表明加樣回收率良好。

三、討論

用蒽酮-硫酸法可以檢測樣品中所有可溶性多糖，所以，在無

需確定多糖種類的情況下，用該方法無疑是有效和快捷的。唯一的不足之處在于無法測出不溶性糖類，從而導致實驗結果偏低。用蒽酮-硫酸法測定蒲公英多糖含量，實驗結果的重現性、穩定性和加樣回收率均在良好的范圍內。該方法最好用葡聚糖做標準品，但是葡聚糖標準品在國內很難獲得，所以在實際應用中多以葡萄糖代替，雖然導致測定結果偏高，但是在可控范圍內。

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基金項目：合肥職業技術學院自然科學基金資助項目（zryb

201310）

（作者單位 合肥職業技術學院生物應用技術系）

編輯 趙飛飛