乙型肝炎病毒的基因分型及其多藥耐藥位點變異與耐藥性的相關性研究*

張 寶 ，李世龍 ，葛保民 ，秦 莉 ，田珊紅 ，周秀艷 ，李 霞

（1.河北省唐山市傳染病醫院，河北 唐山 063000； 2.河北省唐山市人民醫院，河北 唐山 063000；3.河北省唐山市工人醫院，河北 唐山 063000）

目前，大多數乙型肝炎病毒（HBV）基因型研究的重點是A－F基因型。HBV的P區可編碼DNA復制所需的末端蛋白，而且參與了病毒復制的全過程，始于約2500 bp，C區與開始區段重疊，中間區段與S區重疊，最后片段與X區重疊。研究認為，HBV對核苷類似藥物耐藥性的產生與HBV P基因多位點的變異有關。本研究中采用毛細管電泳直接測序技術檢測了HBV基因型A－F及HBV P 區的 rtV173L，rtL180M，rtA181V ／T ／S，rtT184A ／G ／I／S，rtS202G ／I，rtM204V ／I，rtV207I／L ／G，rtS213T，rtV214A，rtQ215S，rtN236T，rtP237H，rtN238T ／D，rtM250V ／I位點突變情況并進行分析。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本來源、試劑及儀器

樣本為2010年至2012年河北省唐山市傳染病醫院門診和住院部239例需要抗病毒治療的慢性乙型病毒性肝炎患者。其中男195例，年齡18～77歲，平均44.48歲；女44例，年齡20～63歲，平均 41.29歲；HBV－DNA均呈陽性，且 HBV－DNA≥104拷貝／mL；診斷符合《乙型肝炎防治指南》中的診斷標準。HBV及耐藥突變檢測試劑盒（核酸擴增熒光定量及測序法），購自上海申友生物技術有限責任公司。ABI 310型系列PCR熒光檢測儀；Sequencing Analysis5.2軟件。

1.2 方法

采用核酸擴增技術結合熒光標記探針雜交方法，對HBV－DNA進行定量檢測。對定量檢測HBV－DNA≥5×103拷貝／mL的樣本，取其PCR產物3μL，再加入2μL蝦堿性磷酸酶（SAP）的混合物，混勻，37℃ 60 min，80℃ 15 min，最后于 4℃保存。取陽性PCR酶解產物3μL、測序試劑（bigdye）1μL和測序產物2μL進行PCR擴增，DNA測序產物經一系列步驟純化后上機電泳，在自動化的ABI310型基因分析儀上進行測序。

1.3 統計學處理

收集整理原始數據錄入計算機，采用SPSS 17.0統計軟件進行處理。

2 結果

在使用抗病毒藥物的239例患者中，利用毛細管電泳法檢測到B基因型HBV感染者30例（12.55%），C基因型HBV感染者203例（84.94%）；D基因型 HBV感染者 1例（0.42% ），5例（20.%）HBV感染者低于最低檢測限。可見，本組患者HBV基因型主要是C型和B型，這一結果與謝秀琴等［1］的研究結果相似。D基因型是在我國北方地區較少發現的基因型。但本研究中未檢出B和C混合型的基因型，這可能與病例數少或存在地區性差異有關，有待進一步跟蹤。239例患者HBV耐藥性情況見表1。

3 討論

目前全球約1／3的人曾感染過HBV，其中有3.6億人發展為慢性乙型病毒性肝炎，我國約有慢性HBV感染者1.3億人，且每年死于HBV持續感染相關疾病［2］，包括肝細胞癌（HCC）的至少有100萬人，最值得關注的是慢性HBV持續感染會發展為肝硬化、肝癌，嚴重威脅著人類的健康。國內外公認的抗HBV藥物主要有干擾素和核苷（酸）類似物兩大類，常用的核苷（酸）類似藥物有拉米夫定、阿德福韋酯、替比夫定和恩替卡韋等，它們通過抑制HBV復制而在治療過程中促使乙型肝炎e抗原（HBeAg）的血清學轉換，并最終清除病毒，從而控制病情的進展。對于慢性抗HBV感染者，HBV治療需要長期用藥，通常情況下至少需要2年，若未經專科醫生同意，在病情緩解不穩固的情況下停藥，不僅不能抑制病毒，還可能加速病毒耐藥的發生，甚至使病毒的復制反彈，導致病情加重。臨床研究表明，拉米夫定治療1，2，3，4年的基因耐藥率分別為14%，38%，49%，66%；阿德福韋酯治療1，2，3，4，5年的基因耐藥率為0，3%，11%，18%，29%；在拉米夫定治療失敗的患者中，恩替卡韋治療1，2，3年的基因耐藥率為6%，14%，32%，其中伴有病毒反彈的臨床耐藥率分別為1%，10%，25%［3－4］。因此，在用藥過程中及時檢測病毒耐藥情況，有利于臨床及時調整用藥方案，控制病情進一步發展。

表1 239例患者血清樣本HBV耐藥情況

HBV有較高的突變率和復制率，高度易突變性體現在，其DNA多聚酶在DNA復制過程的逆轉錄環節缺失校正活性，且HBV的各個基因區及多數調控元件都可能發生變異。另外，某些位點的變異可影響多個基因片段，原因就在于HBV基因存在基因重疊，變異病毒株可改變免疫原性和致病性，引起宿主免疫應答的相應變化，導致病情加重并趨復雜化，甚至惡性化成重癥肝炎；而且在長期HBV感染過程中HBV發生變異，會引起病毒DNA與宿主DNA發生整合，誘導肝癌的發生。

有文獻報道，拉米夫定變異的多為YMDD花式區域的rtM204V／I，而本研究檢測出拉米夫定主要的變異除rtM204V／I外，還有 rtL180M 變異及 rtV173L變異和 rtV207I／L／G，rtS213T變異，與 Aye 等［5］和 Hussain 等［6］的報道有一致性，大大提高了耐藥檢出率。這也提示rtV173L突變伴隨M180＋M204出現可能與拉米夫定耐藥相關，驗證了William等［7］的報道。本研究中共檢出對拉米夫定耐藥的患者101例，占42.26%，其中8例拉米夫定耐藥血清中同時有3例對替比夫定耐藥，為單獨rtM204I／V／S變異所致；檢出對阿德福韋酯耐藥43例，占17.99%，耐藥率明顯低于拉米夫定，主要是 rtN236T，rtA181V ／I／S，rtN ／H238T ／D位點變異，并有1例rtV214A變異，1例rtN236T野生和突變共存株，1例rtQ215S野生和突變共存株，2例rtP237H野生和突變共存株；目前發現的恩替卡韋耐藥突變大多發生于拉米夫定耐藥的患者，主要由 rtM250V ／L，rtT184A ／G ／I／S，rtS202G ／I結合rtM204I／V／S＋rtL180M突變組成。另外，隨著抗病毒藥物的長期應用，有35.56%的患者出現了拉米夫定、替比夫定和恩替卡韋共同耐藥，甚至已有3.35%的患者出現了拉米夫定、阿德福韋酯、替比夫定和恩替卡韋4種抗病毒藥共同耐藥的情況，這明顯加大了治療難度。

HBV各基因型之間存在著致病性和治療應答方面的差異。可能與C基因型預后不良有關的是：B和C基因型之間的差異性體現在慢性乙型病毒性肝炎B＋C及C基因型患者經拉米夫定治療后HBV－DNA陰轉率、HBeAg血清轉換率及ALT復常率均顯著高于B型慢性乙型病毒性肝炎患者［8］，并且C基因型與炎癥壞死及肝纖維化的關系更為密切，更易引起更嚴重的肝臟疾病如肝硬化和肝細胞癌；在年齡大于30歲的感染者中，尤為明顯的是Ba亞型患者的HBeAg陽性率顯著高于Bj亞型，后者發生肝細胞癌的年齡顯著高于前者。對于拉米夫定耐藥變異的慢性乙型病毒性肝炎患者，YIDD變異主要發生于C基因型，B基因型多發生YVDD變異，且變異后的B基因型的HBV復制水平比C基因型要低，B基因型、C基因型拉米夫定耐藥的HBV病毒學分析對于患者的臨床用藥具有明確的指導價值。研究顯示，拉米夫定與阿德福韋酯聯合用藥對拉米夫定耐藥特別是基因B型HBV更有效［9］，但應考慮長期用藥會產生耐藥性的風險［10］。本研究中利用毛細管電泳法檢測HBV，基因分型和耐藥位點，可指導臨床抗病毒藥物的正確選擇，可以提早2～3個月檢測到耐藥位點的變異情況。因此，適時進行基因耐藥的檢測，可以預防“病毒學突破”的發生，先于臨床發現耐藥現象，可及時指導臨床選擇抗病毒藥物，從而避免人力、物力、財力的極大浪費，提高抗病毒藥物的療效，在一定程度延緩患者由慢性乙型病毒性肝炎發展為肝硬化、肝癌。

參考文獻：

［1］謝秀琴，許家璋，李 平，等.江蘇地區乙型肝炎病毒基因分型及其臨床意義［J］. 疾病控制雜志，2005，9（2）：171 －173.

［2］ Maynard JE.Hepatitis B：global importance and need for control［J］.Vaccine，1990，8（Suppl）：S18 － S20.

［3］Liaw YF，Leung NW，Chang TT，etal.Effectsofextended lamivudine therapy in Asian Patients with chronic hepatitis B.Asia Hepatitis B Lamivudine Study Group［J］.Gastroenterology，2000，119（1）：172 － 180.

［4］ Hadziyannis S，Tassopoulos NC，Chang TT，et al.Longterm adefovir－ dipivoxil treatment induces regression of liver fibrosis in patients with HBeAg － negative chronic hepatitis B：results after 5 years of therapy［J］.Hepatology，2005，42（Suppl1）：754A.

［5］Aye TT，Barthelomeusz A，Shaw T，etal.Hepatitis B virus polymersemutations during antiviral therapy in a patient following liver transp lantation［J］.Hepatol，1997，26（5）：1148 － 1153.

［6］Hussain M，Lok AS.Mutations in the hepatitis B virus polymerase gene associated with antiviral treatment for hepatitis B［J］.Viral Hepatol，1999，6（3）：183 －194.

［7］ W illiam E，Delaney IV.The hepatitis B virus polymerasemutation rt v173 is selected during lamivudine therapy and enhances viral replication in vitro ［J］.Virology，2003，77（21）：11833 － 11841.

［8］方軍偉，顧美芬.拉米夫定治療B、B＋C、C基因型慢性病毒性乙型肝炎患者的臨床療效觀察 ［J］. 中國預防醫學雜志，2009，10（6）：532－533.

［9］Inoue J，Ueno Y，Wakui Y，et al.Four－year study of lamivudine and adefovir combination therapy in lamivudine －resistant hepatitis B patients：influence of hepatitis B virus genotype and resistancemutation pattern［J］.J Viral Hapat，2011，18（3）：206 － 215.

［10］田珊紅，胡金華，張 寶，等.阿德福韋酯聯合拉米夫定治療HBV YMDD變異慢性乙型肝炎療效分析［J］.中國煤炭工業醫學雜志，2013，16（1）：7 － 8.