端粒酶hTERT反義核酸對TRAIL誘導的氟他胺耐受型前列腺癌LNCaP細胞凋亡作用的研究

高曉東陳一戎

1. 甘肅省中醫院血液凈化中心 （蘭州 730050）; 2. 甘肅省人民醫院

端粒酶hTERT反義核酸對TRAIL誘導的氟他胺耐受型前列腺癌LNCaP細胞凋亡作用的研究

高曉東1陳一戎2

1. 甘肅省中醫院血液凈化中心 （蘭州 730050）; 2. 甘肅省人民醫院

目的探討端粒酶（hTERT）基因的兩端部分硫代修飾反義核酸（AS PS-ODN）抑制氟他胺耐受型前列腺癌細胞LNCaP端粒酶活性后，腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）對LNCaP細胞凋亡的增敏作用。方法采用臺盼藍觀察hTERTAS PS-ODN與TRAIL共同作用對雄激素非依賴型前列腺癌細胞LNCaP生長活力的影響；倒置顯微鏡觀察凋亡細胞的形態變化；通過雙標流式細胞儀測定凋亡細胞的百分率。結果hTERTAS PS-ODN作用于LNCaP細胞后加入TRAIL100ng/mL作用48h，LNCAP細胞的抑制率與對照組、正義核酸（S PS-ODN）組、AS PS-ODN組、TRAIL組及S PS-ODN+ TRAIL組相比有統計學差異（P＜0.01）。hTERTAS PS-ODN作用于LNCAP細胞后加入TRAIL作用48h，細胞出現典型的凋亡形態變化。hTERTAS PS-ODN作用于LNCaP細胞后加入100ng/mL TRAIL作用48h, 凋亡細胞的百分率分別與對照組、S PS-ODN組、AS PS-ODN組、TRAIL組及S PS-ODN+TRAIL組相比有顯著性差異（P＜0.05）。結論hTERT基因反義核酸對TRAIL誘導的氟他胺耐受型前列腺癌細胞LNCaP凋亡有增敏作用。

端粒, 末端轉移酶; 寡核苷酸類, 反義; 前列腺腫瘤; 細胞凋亡

前列腺癌是男性泌尿系最常發生的腫瘤,在美國其發病率在腫瘤患者中占第一位，死亡率占第二位[1]。我國尚無前列腺癌發病率、死亡率的精確統計資料，雖遠不及歐美多，但隨著人們生活水平的提

高和人群普查的開展，發病率逐年提高，而且初診時已有30%～50%的前列腺癌患者發生了轉移[2]。研究表明[3]，前列腺癌細胞屬于雄激素依賴性細胞，通過抑制人體睪丸細胞產生的90%的雄激素以及腎上腺組織產生的10%的雄激素，前列腺癌細胞生長速度變緩，出現惰性生長的現象，甚至出現前列腺癌轉移灶萎縮的情況，治療效果良好。隨著抗雄藥物的治療，前列腺癌細胞會由雄激素依賴性轉化為雄激素非依賴型，抗雄藥物治療會逐漸失去作用。而對于雄激素非依賴型前列腺癌的治療，目前臨床上沒有一個行之有效的治療方法，是臨床上最棘手的問題之一。研究表明[4]，人類端粒酶主要在腫瘤組織中表達，而在正常組織及良性腫瘤中，除了一些具有高度再生潛力和生殖細胞組織外，幾乎不表達，表明端粒酶激活與腫瘤發生過程關系密切?，F已證明端粒酶催化亞單位（hTERT）基因mRNA與端粒酶活性表達一致，其上游表達對端粒酶活性表達起重要作用，被認為是端粒酶活性表達的限速因子[5]。近年來有研究表明，雄激素可以調節前列腺癌細胞的端粒酶活性。雄激素阻斷會導致前列腺癌細胞端粒酶限速因子hTERT基因的表達活性受到抑制伴有癌細胞端粒酶活性的降低[6]。但是端粒酶活性抑制劑只能降低腫瘤細胞端粒酶活性，并不影響其增殖。從腫瘤細胞端粒酶活性降低到其增殖受到抑制這一階段是端粒酶活性抑制劑應用的主要障礙。因此，將端粒酶活性抑制劑和常規的放療、化療、免疫治療結合起來，將有效的提高對腫瘤細胞凋亡的作用[7]。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）可以誘導腫瘤細胞的凋亡而不影響正常細胞，因而成為目前抗腫瘤研究的熱點[8]。本實驗通過研究hTERT基因的兩端部分硫代修飾反義核酸（AS PS-ODN）對氟他胺耐受型前列腺癌細胞LNCaP端粒酶活性的影響，探討端粒酶活性抑制對 TRAIL誘導氟他胺耐受型（雄激素非依賴型）前列腺癌細胞LNCaP凋亡的增敏作用，為氟他胺耐受型前列腺癌治療尋找新的途徑。

材料和方法

一、材料

（一）主要試劑

RPMI 1640培養粉為北京天為時代科技有限公司產品，胎小牛血清為蘭州民海生物制品公司產品，臺盼藍為蘭州百奧生物制品公司產品，TRAIL為武漢博士德生物制品公司產品。Annexin-V-FITC凋亡檢測試劑盒為北京天為時代科技有限公司產品。

（二）引物合成

根據hTERT基因mRNA的序列分析，設計出互補于起始密碼子的反義片段共20個堿基長度作用的靶序列。hTERTAS PS-ODN的序列為5'-GGAGCGCGCG GCATCGCGGG-3'，S PS-ODN的序列為5'-CCCGCG ATGCCGCGCGCTCC-3'，每條鏈進行兩端各3個堿基硫代修飾，由北京賽百勝生物制品公司合成，純化，分裝。

（三）細胞培養

LNCaP細胞株由本院泌尿研究所惠贈。采用含10%胎小牛血清（60℃滅活3 min），100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養液，在37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養。LNCaP細胞含10%FBS的RPMI1640培養液中氟他胺用無水乙醇溶解后加入磷酸鹽緩沖液（PBS，常規培養于pH7.2）至氟他胺終濃度為10-4mol/L儲存。LNCaP加入氟他胺至終濃度為10-7mol/L后連續培養80代，使之成為氟他胺耐受前列腺癌細胞LNCaP-f u，實驗選用對數生長期細胞。

二、方法

（一）臺盼藍拒染法檢測細胞活力

實驗分為6組：AS PS-ODN組、正義核酸（S PSODN組）、空白對照組、TRAIL組、TRAIL+ S PSODN組、TRAIL+ AS PS-ODN組。采用24孔培養板，每組接種3孔，每孔接種1×105細胞。第一天加入ODN 10μmol/L，24h后加入100ng/mL TRAIL，空白對照組加入等量培養液。加入TRAIL后24、48、72、96h采用臺盼藍拒染法檢測LNCaP細胞的活力。

（二）細胞凋亡的形態學觀察

置不同作用時間后的細胞于倒置顯微鏡下觀察細胞的形態學變化。

（三）流式細胞儀測定凋亡細胞的百分率

調整細胞待測密度為1×105個/mL，取1mL細胞，冷PBS洗2次（3.38×103g4℃ 離心10 min），細胞懸浮于200μl結合緩沖液中。加入10μl Annexin-VFITC 和5μl的PI，避光室溫反應15 min。加入300 μl結合緩沖液，立即上機檢測。

三、統計學分析

結 果

一、臺盼藍拒染法檢測hTERTAS PS-ODN與TRAIL聯合作用對LNCaP細胞活力的影響

hTERTAS PS-ODN作用于LNCaP細胞24h后加入TRAIL100ng/mL共同作用48h，LNCaP細胞抑制率與AS PS-ODN組，S PS-ODN組，空白對照組，TRAIL組，TRAIL+ S PS-ODN組相比，有顯著性差異（P＜0.01）（見圖1）。

圖1hTERT反義核酸與100ng/mL TRAIL聯合作用48h對LNCaP細胞活力的影響

二、細胞凋亡形態學觀察

hTERTAS PS-ODN作用于LNCaP細胞24h后加入100ng/mL TRAIL共同作用48h，見凋亡細胞明顯增多，呈現為細胞縮小、染色質凝集、核固縮并斷裂形成數個大小不等的圓形顆粒，并釋放到細胞外形成凋亡小體（見圖2）。

三、流式細胞儀測定凋亡細胞的百分率

hTERTAS PS-ODN與100ng/mL TRAIL聯合作用48h，T24細胞凋亡百分率為36.1%，hTERTS PSODN與100ng/mL TRAIL聯合作用48h，T24細胞凋亡百分率為11.2%，100ng/mL TRAIL單獨作用48h，T24細胞凋亡百分率為8.25%，hTERTAS PS-ODN作用組T24細胞凋亡百分率為2.18%，hTERTS PS-ODN作用組T24細胞凋亡百分率為2.0%，對照組T24細胞凋亡百分率為2.0%，hTERTAS PS-ODN與TRAIL聯合作用48h，T24細胞凋亡百分率與單用TRAIL作用組，hTERTS PS-ODN與TRAIL聯合作用組，hTERTAS PS-ODN，hTERTS PS-ODN作用組及對照組進行比較有統計學意義（P＜0.05）。單用TRAIL作用組與hTERTS PS-ODN與TRAIL聯合作用組比較兩者差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

討 論

文獻報道[9]，端粒酶hTERT在各種癌細胞株及腫瘤組織中，表現出高水平的表達，與本實驗結果相符。近年來有研究表明，雄激素可以調節前列腺癌細胞的端粒酶活性，雄激素阻斷會導致前列腺癌細胞端粒酶限速因子hTERT基因的表達活性受到抑制伴有癌細胞端粒酶活性的降低[6]。為雄激素非依賴型前列腺癌治療提供了新的治療方法。

反義技術的基本原理就是根據堿基互補原則，用人工合成或生物體表達的特定互補的DNA或RNA片段（反義核酸）以抑制或封閉專一靶基因表達的技術。本實驗采用兩端部分硫代修飾反義核酸。硫代是指硫元素代替硫酸基團自由氧，是目前反義核酸應用研究最多的一種修飾，可以增強反義核酸的穩定性，提高反義核酸對核酸酶的耐受性，使其藥物半衰期增加10倍，同時增強反義核酸對腫瘤細胞的親核性，從而使反義核酸更容易進入腫瘤細胞核內發揮其抗腫瘤作用。

圖2hTERTAS PS-ODN作用于LNCaP細胞24h加入TRAIL共同作用48h，倒置顯微鏡下觀察細胞的形態

圖3hTERT反義核酸與TRAIL100ng/mL聯合作用48h，LNCaP細胞凋亡百分率

本實驗結果表明，LNCaP細胞經過hTERTAS PS-ODN與TRAIL聯合作用，細胞活力明顯受到抑制，出現了細胞凋亡的形態學改變，呈現為細胞縮小，染色質凝集，核固縮并出現凋亡小體，同時，LNCaP細胞凋亡百分率明顯增高。這與文獻報道的有關反義核酸作用的研究一致[10]。

有研究表明，TRAIL是腫瘤壞死因子（TNF）細胞因子家族的新成員，和TNF、凋亡相關因子配體（FasL）一樣，TRAIL也是通過與細胞膜上的相應的死亡受體（DR4, DR5）結合，激活Caspase通路，傳遞和放大凋亡信號，從而誘導靶細胞發生快速、大量、高效的凋亡反應[11]。TRAIL與其受體DR4,DR5特異性結合激活信號轉導系統，啟動凋亡程序的進行[12]。DR4,DR5同樣是一種促進細胞凋亡的基因，可以合成執行細胞凋亡的酶：核酸內切酶（DNase）和凋亡蛋白酶（caspase）。前者導致腫瘤細胞染色體DNA 片段化，后者水解細胞的蛋白質結構，導致細胞的全面解體[13]。抑制hTERT表達后，腫瘤細胞失去了DNA修復能力，使染色體片段化，同時削弱了腫瘤細胞對DNA損傷的反應[14]，因而加速了TRAIL對腫瘤細胞的凋亡作用。

總之，hTERT AS PS-ODN抑制了端粒酶hTERT表達可以增加LNCaP細胞對TRAIL誘導凋亡的敏感性。采用端粒酶活性抑制劑結合腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體治療氟他胺耐受型前列腺癌具有良好應用前景。

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3 Hara T, Migazakin J, Araki H,et al. Novel mutations of androgen reception-A possible mechanism of bicalutamide withdrawal syndrome.Cancer Res2003; 63(1): 149-153

4 Feng J, Funk WD, Wang SS,et al. The RNA component of human telomerase.Science1995; 269(5228): 1236-1241

5 Guo C, Armbruster BN, Price DT. In vivo regulation of hTERT expression and telomerase activity by androgen.J Urol2003; 21(2 Pt 1): 615-618

6 Denmeade SR, Isaacs JT. Development of prostate cancer treatment: a good news.Prostate2004; 58(3): 211-224

7 Biroccio A, Leonetti C. Telomerase as a new target for the treatment of hormone-refractory prostate cancer.Endocr Relat Cancer 2004; 11(3): 407-421

8 Aggarwal BB, Bhardwaj U, Takada Y. Regulation of TRAIL induced apoptosis by ectopic expression of antiapoptotic factors.Vitam Horm2004; 67: 453-483

9 Nakayama J, Tahara H, Tahara E. Telomerase activation by hTERT in human normal f broblasts and hepatocellular carcinomas.Nat Genet1998; 3(4): 65-68

10 Yuan Z, Mei HD. Inhibition of telomerase activity with hTERT antisense increases the effect of CDDP-induced apoptosis in myeloid leukemia.Hematol J2002; 3: 201-205

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12 Wu XX, Kakehi Y, Mizutani Y,et al.Enhancement of TRAIL/Apo2L mediated apoptosis by adriamycin through inducing DR4 and DR5 in renal cell carcinoma cells.Int J Cancer2003, 104(4): 409-417

13 欽憲, 何麗婭, 李平法. 醫學分子生物學. 鄭州: 鄭州大學出版社, 2003: 105-116

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（2014-01-10收稿）

Effects of telomerase inhibition with hTERT antisense on TRAIL-induced apoptosis in flutamide insensitive prostate cancer cells (LNCaP)

Gao Xiaodong1, Chen Yirong2
1. The Traditional Chinese Medicine Hospital of Gansu Province, Lanzhou 730050, China;
2. The People Hospital of Gansu Province

ObjectiveTo investigated the effects of telomerase inhibition withhTERTantisense on TRAIL-induced apoptosis in flutamide insensitive prostate cancer cells (LNCaP).MethodsAntisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide (AS PS-ODN) was synthesized and purified. Cell viability was determined by MTT assay.Cell apoptosis was observed by morphological method and measured by f owcytometry.ResultsAS PS-ODN could signif cantly increase TRAIL-induced apoptosis in LNCaP cells.ConclusionInhibition of telomerase withhTERTantisense can enhance TRAIL-induced apoptosis in f utamide insensitive prostate cancer cells (LNCaP).

telomerase; oligonucleotides, antisense; prostatic neoplasms; apoptosis

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.05.005

R 737.25