中國漢族人群DNMT基因單核苷酸多態性與弱精子癥的相關性研究

李 琦歐光鑫楊學習余慶鋒葉祿偉毛向明*

1. 南方醫科大學附屬南方醫院泌尿外科（廣州 510515）; 2. 肇慶市第一人民醫院泌尿外科; 3. 南方醫科大學生物技術學院抗體工程研究所; 4. 汕頭市中心醫院泌尿外科

中國漢族人群DNMT基因單核苷酸多態性與弱精子癥的相關性研究

李 琦1△歐光鑫2△楊學習3余慶鋒4葉祿偉1毛向明1*

1. 南方醫科大學附屬南方醫院泌尿外科（廣州 510515）; 2. 肇慶市第一人民醫院泌尿外科; 3. 南方醫科大學生物技術學院抗體工程研究所; 4. 汕頭市中心醫院泌尿外科

目的探討DNMT基因（DNA methyltransferase）單核苷酸多態性（SNP）與弱精子癥男性不育的關系。方法本研究檢測了中國南方人群中DNMT1 （rs2114724, rs2228611, rs2228612, rs8101866, rs16999593）, DNMT2 （rs11254413），DNMT3A （rs1550117, rs11887120, rs13420827, rs13428812, rs6733301）, DNMT3B（rs2424908,rs2424913）和DNMT3L （rs113593938）14個SNPs與弱精子癥的相關性。運用Sequenom MALDI-TOFMS 平臺技術對特發性弱精子癥不育患者（病例組，n=195）和正常精子活力男性（對照組，n=184）精液樣本DNA進行基因分型。通過遺傳平衡檢驗（Hardy-Weinberg Equilibrium test, HWE）樣本結果，卡方檢驗和logistic回歸分析所有基因型分布和等位基因頻率。結果這些檢測的SNPs中，DNMT3A基因rs13428812位點與弱精子癥相關（OR=1.54;95%CI：1.02-2.13;P= 0.039）。其余位點未檢查出與弱精子癥的相關性。結論 DNMT3A基因rs13428812位點可能與弱精子癥密切相關，但是機制尚不明確。

弱精子癥; DNA甲基轉移酶; 多態性, 單核苷酸; 精子能動性; 漢族

DNA甲基化（DNA methylation）是一種復制后修飾，發生在絕大多數原核生物和真核生物基因組中，對維持基因表達、基因印記、染色體的完整和X染色體的失活都起重要的作用。在哺乳動物中，DNA甲基化是由DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）建立和維持的。最新研究發現，異常的基因甲基化與男性不育和精子活力不足具有緊密的聯系[1-4]。然而，弱精子癥與DNA甲基轉移酶基因單核苷酸多態性（SNP）的相關性研究很少。本文旨在研究DNMT基因14個SNPs位點是否與弱精子癥男性不育相關。

材料與方法

一、研究對象

研究對象為在我院以不育為主訴就診的精子活力不足的男性患者，所有患者均為婚后未行避孕措施1年以上而未能生育，均排除生殖道感染、精索靜脈曲張、不良生活習慣、激素水平異常及系統性疾病等可能導致精子活力下降的因素，配偶檢查未見明顯異常。弱精子癥的診斷按照1999年WHO的診斷標準[5]，病例組的納入標準：a級精子＜25%并且（a+b）級精子＜50%，其他精液參數無明顯異常。對照組納入標準為：任意一次精液檢查提示精子活力正常（a級精子≥25或a級+b級精子≥50%），其他精液參數無明顯異常者。所有納入研究者均精子濃度＞20×106/mL并且精液白細胞濃度＜2×106/mL。共有195位弱精子癥男性（年齡范圍21～56歲）及184位正常男性志愿者（年齡范圍21～56歲）納入研究。該研究經本院倫理委員會批準，所有研究對象均予告知并簽署知情同意書。

二、方法

（一）精液獲取及精子活力分析

所有納入研究對象均禁欲2～7d，手淫取出精液，置于37℃水浴箱內液化1h，采用MicroPtic公司生產的SCA精子質量分析儀對樣本進行精液常規分析。

（二）精子提純和DNA的提取

經液化及活力分析后的精液，采用50% percoll提純精子，離心機2 000×g，離心15min，然后用1倍的PBS清洗2次備用。采用基因組DNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）提取精子總DNA，儲存于-80℃。Nanodrop 分光光度計測定所提取基因組DNA的濃度與純度。

（三）SNP位點選擇和基因型分析

從公共單核苷酸多態性數據庫（single nucleotide polymorphism database，dbSNP）[6]中選擇DNMT基因的14個SNPs位點。14個SNPs位點的具體信息見表1。用Assay Design 4.0軟件設計PCR引物（Sequenom, San Diego, CA），利用MassARRAY平臺進行基因型分型（Sequenom, San Diego, CA）。DNA樣品質控設置在90%水平。

表1 從DNMT基因中選擇出的SNP位點

三、統計學分析

采用SPSS13.0統計軟件處理數據，各SNP位點基因型頻率的Hardy- Weinberg平衡適合度檢驗采用x2適合性檢驗，基因型和等位基因頻率分布差異采用x2獨立性檢驗，DNMTs基因型與弱精子癥之間的相關性采用比值比（OR）和95%可信度區間（95%CI）分析。

結 果

在病例組和對照組中，我們總共分析了14個SNPs。基因型分析結果如表2。其中，有兩個位點（rs2228612和rs11254413）的基因型分布頻率不符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（P＜0.05）。此外，DNMT3A基因rs13428812位點與弱精子癥易感性密切相關。在病例組中，rs13428812位點基因型AA、GA-GG分布頻率分別為49.2%、50.8%，對照組中分別為59.8%、40.2%，兩組比較差異有統計學意義（P=0.039）。對比AA與GG，雜合子基因型AG可能會增加患弱精子癥的風險（OR=1.54; 95%CI: 1.02-2.13;P= 0.039）。DNMT3L基因rs113593938位點可能與弱精子癥密切相關（P=0.009），但是，在對照組中沒有發現基因型TC的分布，所以OR值無法計算。其余位點未檢出與弱精子癥有相關性。

表2 病例組與對照組中DNMT基因單核苷酸多態性分析結果

討 論

文獻報道稱目前15%的育齡夫婦存在不孕不育，其中男性因素占45%～50%[7]。Curi等[8]的研究發現弱精子癥或精子活力不足是引起男性不育的常見因素。

DNA甲基化是表觀遺傳學的重要組成部分，在維持正常細胞功能、基因印記、胚胎發育以及人類腫瘤發生中起著重要的作用。目前有研究提示，男性不育癥患者，包括少弱精子癥、無精子癥等，其精子中DNA甲基化有著明顯的異常[9]，人們推測，精子發生相關基因的異常DNA甲基化與不育之間有著密切的聯系，并且有遺傳傾向，造成子代不育。

異常的DNA甲基化主要發生于精子形成時。根據Pacheco等[10]的研究發現，CpG島甲基化和mRNA的改變與精子活力不足相關。Nanassy等[1]研究發現CREM基因啟動子異常甲基化會導致精液中魚精蛋白異常和嚴重少精子癥不育，同時，此甲基化作用越強，精液質量越差。Hammoud等[3]研究證實，與正常人相比，精液中魚精蛋白異常和嚴重少精子癥不育患者在印跡基因位點（LIT1, SNRPN, MEST, ZAC, PEG3）存在整體甲基化模式的顯著改變。除此之外，研究還發現，H19, DAZL, MTHR基因的異常甲基化與精子形成密切相關[4,11,12]。

到目前為止，在哺乳動物中發現了三種DNA甲基轉移酶，分別為DNMT1, DNMT2 和 DNMT3（DNMT3A and DNMT3B DNMT3L）[13]。DNMT1的主要作用是維持DNA甲基化，這種維持作用可以將DNA甲基化信息傳遞給子代細胞。DNMT2，主要為tRNA的甲基轉移酶，其生物學功能尚不十分明確。目前認為，DNMT2的DNA甲基化酶活性非常弱，但是Goll等[14]的研究發現，它能夠特異性甲基化tRNAAsp反密碼子環38C。DNMT3A、DNMT3B具有類似的結構，被稱之為從頭甲基轉移酶。DNMT3L是一種DNMT3類似蛋白，與DNMT3A和DNMT3B相結合，但是缺乏單獨的催化活性。它能增強從頭甲基轉移酶的催化活性，并且只在處于從頭甲基化發生的生殖細胞中表達[15]。

越來越多的研究表明，DNA甲基轉移酶與精子發生密切相關[4,16-18]。DNMT3A在原始生殖細胞發育過程中起著至關重要的作用，其異?？赡軙е翫NA甲基化改變從而導致癌癥的發生。La Salle等[16]在2004年的研究顯示，DNMT3家族（DNMT3A, DNMT3B and DNMT3L）具有顯著的基因獨特性和生殖細胞系特有的表達模式，并且DNMT3A和DNMT3L在男性生殖細胞系的從頭甲基化過程中存在相互作用。在隨后2006年的研究中發現，DNMT3A在增殖和分化的男性生殖細胞甚至精子細胞中表達。La Salle的研究證實，在粗線期，無論是RNA水平還是蛋白質水平，DNMT3A的表達都是下調的[19]。Marques等[4]研究表明，在精子形成的整個過程中，DNMT3均有表達，作用可能是維持DNA甲基化模式以避免基因組印記錯誤的雄性配子的傳遞。然而，Lees Murdock等[17]卻發現DNMT3家族僅僅在生殖細胞處于從頭甲基化的時期出現。

雖然之前的很多研究均表明DNMT與精子發生密切相關，但是DNMT基因單核苷酸多態性與精子活力不足的相關性還未見報道。因此，我們的研究第一次證實了DNMT3A基因rs13428812位點與弱精子癥男性不育可能存在密切關系。另外，如果樣本量足夠大的話，DNMT3L基因rs113593938位點也可能檢出與弱精子癥相關。但是，本次研究納入的樣本數較少，病例組與對照組均少于300例，且局限于中國南方人群，并且精液質量特性中一些變異基因型之間的差異性尚不清楚。因此，針對更大樣本、不同地區人群以及體內外功能研究是非常必要的，以此來證實本文的結果及其探討造成弱精子癥的機制。

1 Nanassy L, Carrell DT. Abnormal methylation of the promoter of CREM is broadly associated with male factor infertility and poor sperm quality but is improved in sperm selected by density gradient centrifugation.Fertil Steril2011; 95(7): 2310-2314

2 Sato A, Hiura H, Okae H,et al.Assessing loss of imprint methylation in sperm from subfertile men using novel methylation polymerase chain reaction Luminex analysis.Fertil Steril2011; 95(1): 129-134, 134.e1-e4

3 Hammoud SS, Purwar J, Pf ueger C,et al. Alterationsin sperm DNA methylation patterns at imprinted loci in two classes of infertility.Fertil Steril2010; 94(5): 1728-1733

4 Marques CJ, Francisco T, Sousa S,et al.Methylation defects of imprinted genes in human testicular spermatozoa.Fertil Steril2010; 94(2): 585-594

5 WHO.WHO Laboratory manual for the examination of human semen and semen-cervica mucus interaction(Aed). Cambridge. London: Cambridge University Press,1999

6 NCBI SNP Database. Available online: http://www.ncbi. nlm.nih.gov/projects/SNP/ (accessed on 13 October 2011)

7 Jungwirth A, Giwercman A, Tournaye H, et al. European Association of Urology guidelines on Male Infertility: the 2012 update.Eur Urol2012; 62(2): 324-332

8 Curi SM, Ariagno JI, Chenlo PH,et al.Asthenozoospermia: analysis of a large population.Arch Androl2003; 49(5): 343-349

9 Carrell DT. Epigenetics of the male gamete.Fertil Steril2012; 97(2): 267-274

10 Pacheco SE, Houseman EA, Christensen BC,et al.Integrative DNA methylation and gene expression analyses identify DNA packaging and epigenetic regulatory genes associated.PLoS One2011; 6(6): e20280

11 Navarro-Costa P, Nogueira P, Carvalho M,et al. Incorrect DNA methylation of the DAZL promoter CpG island associates with defective human sperm.Hum Reprod2010; 25(10): 2647-2654

12 Wu W, Shen O, Qin Y,et al. Idiopathic male infertility is strongly associated with aberrant promoter methylation of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR).PLoS One2010; 5(11): e13884

13 Goll MG, Bestor TH. Eukaryotic cytosine methyltransferases.Annu Rev Biochem2005; 74: 481-514

14 Goll MG, Kirpekar F, Maggert KA, et al. Methylation of tRNAAsp by the DNA methyltransferase homolog Dnmt2.Science2006; 311(5759): 395-398

15 Bourc'his D, Xu GL, Lin CS,et al.Dnmt3L and the establishment of maternal genomic imprints.Science2001; 294(5551): 2536-2539

16 La Salle S, Mertineit C, Taketo T,et al. Windows for sex-specif c methylation marked by DNA methyltransferase expression prof les in mouse germ cells.Dev Biol2004; 268(2): 403-415

17 Lees-Murdock DJ, Shovlin TC, Gardiner T,et al. DNA methyltransferase expression in the mouse germ line during periods of de novo methylation.Dev Dyn2005; 232(4): 992-1002

18 Takashima S, Takehashi M, Lee J,et al.Abnormal DNA methyltransferase expression in mouse germline stem cells results in spermatogenic defects.Biol Reprod2009; 81(1): 155-164

19 La Salle S, Trasler JM. Dynamic expression of DNMT3a and DNMT3b isoforms during male germ cell development in the mouse.Dev Biol2006; 296(1): 71-82

（2014-01-10收稿）

Association of DNMT Polymorphisms with Asthenozoospermia in a Chinese Han population

Li Qi1△, Ou Guangxin2△, Yang Xuexi3, Yu Qingfeng4, Ye Luwei1, Mao Xiangming1*
1. Department of Urology, Nanfang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510515,Guangdong, China; 2. Department of Urology, the First People's Hospital of Zhaoqing;3. School of Biotechnology, Southern Medical University;
4. Department of Urology, Shantou Central Hospital

Mao Xiangming,E-mail:mxm@f mmu.com

ObjectiveTo investigate the association betweenDNMTgene polymorphism and asthenozoospermia.MethodsThe associations of 14 single nucleotide polymorphisms (SNPs) from DNMT1 (rs2114724, rs2228611, rs2228612, rs8101866, rs16999593), DNMT2 (rs11254413), DNMT3A (rs1550117, rs11887120, rs13420827, rs13428812, rs6733301), DNMT3B (rs2424908, rs2424913) and DNMT3L (rs113593938) with asthenozoospermia in the population of South China were assessed in the study. The SNPs genotyping was carried out in 195 idiopathic asthenospermia patients and 184 age-matched healthy volunteers using the Sequenom MALDI-TOF-MS platform. After HWE, the genotype and allele frequencies were calculated and analyzed with Chi-square test and logistic regression.ResultsAmong these SNPs, rs13428812 in DNMT3A was signif cantly associated with increased asthenozoospermia risk (odds ratio [OR], 1.54; 95% conf dence interval [95%CI], 1.02-2.13; P = 0.039). However, no other associations were found. Conclution These results indicate that DNMT3A (rs13428812) may contribute to asthenozoospermia, but the detail mechanisms were still unknown.

asthenozoospermia; DNA methyltransferase; polymorphism, single nucleotide; sperm motility; Han nationality

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.05.004

R 698.2

△共同第一作者

*通訊作者, E-mail: mxm@f mmu.com