去甲斑蝥素主動肝靶向性藥物設計研究進展

趙巖 蔣洪 嘎魯 米雪 楊慧

肝臟腫瘤是常見的惡性腫瘤之一，它病程短，死亡率高，對人類健康威脅極大。去甲斑蝥素(norcantharidin，NCTD)是斑蝥素的衍生物，是中國自主研發的具有較強抗腫瘤活性和獨特升高白細胞、保護肝細胞、調節免疫等作用的新型抗腫瘤藥物［1］，其毒性明顯比斑蝥素低，而抗腫瘤作用優于斑蝥素［2］，臨床上用于肝癌的治療或輔助治療，顯示出較好的療效［3］。

NCTD 主要以片劑和注射劑應用于臨床，魏春明等［4］研究了去甲斑蝥素小鼠體內藥代動力學與組織分布，研究結果顯示，小鼠口服3H-去甲斑蝥素吸收迅速，肝臟分布少且消除快，腎臟則分布多，但消除也快。體內分布結果表明NCTD 用于治療肝癌到達靶器官的濃度低，因此不僅藥效減弱，而且對其他臟器有較大的毒性。為更好的發揮其療效，降低毒副作用，延長作用時間，藥學工作者就其肝靶向性藥物設計進行大量的研究，取得了一定進展。靶向藥物設計是通過優化藥物傳輸過程，使藥物按照預定目標到達某器官、組織或靶點，增加藥物在靶點或作用部位的生物利用度，同時減少在其他部位的作用，以減少毒副作用，提高治療效果的一種設計方法［5］。實現藥物的主動肝靶向傳輸過程的靶向藥物設計是依據受體—配體結合或抗原—抗體結合等生物特異性相互作用原理。近幾年進行的去甲斑蝥素主動肝靶向的研究主要有單克隆抗體導向藥物，去唾液酸糖蛋白受體介導的前體藥物及表面修飾的納米粒和脂質體等。

1 單克隆抗體導向NCTD 主動肝靶向藥物研究

將單克隆抗體作為特異性載體與藥物的功能基或與經過修飾后的功能基團相連結，生成單克隆抗體—藥物偶聯物，制成導向藥物，利用單克隆抗體特異性趨向于抗原的特性，將藥物高濃度地輸送到靶點細胞表面，再經化學或酶催化方式斷裂偶聯鍵分解出藥物原型，在作用靶點細胞局部形成可以產生藥理活性所需要的藥物濃度而發揮作用，從而減少藥物向非靶位的分布和結合，降低藥物的毒副作用。

梁福佑等［6］采用抗人肝癌大鼠單克隆抗體3A5與去甲斑蝥素偶聯，以克隆生成法觀察偶聯物經靜脈給藥和腫瘤局部給藥對腫瘤的治療作用，結果顯示偶聯物對裸鼠移植人肝癌BEL-7402 細胞具有比去甲斑蝥素更強的細胞毒性。靜脈給藥時，去甲斑蝥素和其偶聯物對腫瘤的抑制率分別為15% 和63%，瘤結周圍給藥時，去甲斑蝥素和其偶聯物對腫瘤的抑制率分別為47%和78%，提示偶聯物對靶細胞的殺傷力強于游離去甲斑蝥素，說明單克隆抗體3A5 與去甲斑蝥素偶聯物對肝臟腫瘤具有良好的導向性。單抗偶聯物雖具有體內分布特異性，但因單抗偶聯物為大分子物質，較難穿過細胞外間隙到達實體瘤的深部，因此到達腫瘤細胞的藥物量仍屬有限，這也是研究單抗偶聯物時需解決的問題之一。

2 受體介導NCTD 主動肝靶向藥物研究

受體與配基的結合具有高度的專一性，受體的結合部位能夠專一性的識別相應配基并與之結合，這種局部結構的專一性匹配是受體介導靶向藥物的理論基礎［5］。

2.1 去唾液酸糖蛋白受體介導NCTD 的研究

去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)是一種表達在肝實質細胞表面的專一性識別末端含有半乳糖或乙酰氨基半乳糖的糖蛋白去唾液酸糖蛋白受體，又稱半乳糖受體。由于半乳糖殘基修飾藥物在體內具有較強的穩定性，以及其修飾較為方便，且其修飾物具有較好的靶向性等諸多優點，以半乳糖殘基為配體修飾藥物來實現肝靶向是去唾液酸糖蛋白受體介導的肝靶向研究中最多的［7-10］。通常將藥物或載體等經半乳糖糖基化制成以ASGPR 受體為介導的肝靶向前體藥物或半乳糖基修飾的載藥微粒［11-13］。

2.1.1 NCTD 半乳糖化前藥 前體藥物簡稱前藥，是活性藥物經過化學修飾后得到的化合物，在體內通過酶的作用又轉化為原來的藥物而發揮藥效，以利于藥物的吸收、分布、代謝和排泄［1］。因此，能通過改變靶器官的pH 值和某些酶的活性來實現母藥的定位釋放。

范峰等［14］以去甲斑蝥素為原料，以各種小分子氨基酸修飾后，過酰化、氫解、糖苷化和脫乙酰基反應，合成了去甲斑蝥素—半乳糖衍生物(見圖1)，期望得到肝靶向抗癌前藥。對產物a(見圖1)進行初步小鼠體內抗腫瘤實驗的結果顯示，化合物a 中、高劑量組抑瘤率明顯高于NCTD 組，表明半乳糖苷化對NCTD 的抗癌作用有一定提高，肝靶向性有待進一步的研究。

圖1 范峰等合成的去甲斑蝥素—半乳糖衍生物

胡展紅等［11］以乙二胺為連接臂將去甲斑蝥素和乳糖酸連接合成了前體藥物乳糖化—去甲斑蝥素(1actosyl-norcantharidin，Lac-NCTD)(見圖2)，期望利用分子結構上的半乳糖殘基被體內肝細胞的AS-GP-R 特異性識別，達到主動肝靶向性的目的。急性毒性研究結果顯示Lac-NCTD 的毒性遠小于NCTD，是一種安全無毒的新化合物［12］。

圖2 胡展紅等合成的乳糖化去甲斑蝥素

2.1.2 半乳糖修飾的NCTD 納米粒 納米粒是大小在10～1000 nm 之間的固態膠體顆粒，可作為傳輸藥物的載體，將藥物包封于納米粒中，可調節釋藥速度、增加生物膜的通透性、改變藥物在體內的分布以及提高藥物生物利用度等［13］。對納米粒進行表面修飾，如在其表面耦聯特異性的靶向分子(特異性的配體、單克隆抗體等)，納米粒可通過靶向分子與細胞表面特異性受體結合從而實現主動靶向治療［15］。

胡展紅等［16］、管敏等［17］采用噻唑基四唑比色法考察NCTD、Lac-NCTD 及乳糖化-去甲斑蝥素納米粒(Lactose-oriented-to cantharidin nanoparticles，Lac-NCTD-NPs)對腫瘤細胞株HepG2、SMMC-7721 和SGC-7901 的細胞毒作用;通過H22 荷瘤小鼠模型考察藥物體內對肝癌的抑制作用。體外細胞毒試驗結果顯示，Lac-NCTD 及Lac-NCTD-NPs 對上述腫瘤細胞具有強抑制活性;小鼠體內抑瘤實驗結果顯示Lac-NCTD-NPs 中劑量的抑瘤率為63.9%，顯著高于相同濃度的NCTD 和Lac-NCTD。說明Lac-NCTD-NPs 能有效地靶向于肝腫瘤組織，抑制腫瘤的生長，是一種較強的具有體內外抗癌活性的新型肝靶向性制劑。

管敏等［18］采用Caco-2 細胞單層模型，研究了Lac-NCTD 及Lac-NCTD-NPs 的細胞攝取、轉運機制。得到結論:Lac-NCTD 主要以主動轉運方式被吸收，少部分通過旁路轉運被Caco-2 細胞攝取和轉運，此過程受P-糖蛋白和多藥耐藥相關蛋白2 外排蛋白的影響，且藥物納米粒的攝取和轉運較其溶液均有增加。在細胞攝取和轉運中，Lac-NCTD-NPs 的攝取量、滲透系數均比相同質量濃度Lac-NCTD 溶液的對應值要大，提示殼聚糖包裹的Lac-NCTD 納米粒制劑有利于細胞的藥物吸收。

殼聚糖是生物可降解并和生物相容、天然無毒的高分子堿性氨基多糖，帶正電荷，具有獨特的跨細胞膜能力。腫瘤細胞具有比正常細胞表面更多的負電荷，殼聚糖在酸性環境中選擇性吸附腫瘤細胞表面并起電中和作用，能直接抑制腫瘤細胞，通過活化免疫系統抑制腫瘤細胞活性，文獻研究報道［19-21］將半乳糖基引入到殼聚糖的結構有望成為潛在的肝靶向載體。

匡長春等［22］研究去甲斑蝥素殼聚糖納米粒在小鼠體內的分布并以靶向指數targeting index，TI)判斷其對主要臟器的靶向性。結果顯示去甲斑蝥素殼聚糖納米粒在肝臟中的濃度明顯高于去甲斑蝥素，具有明顯的靶向作用，對其他組織則無靶向作用。

胡瑋等［23］以N-乳糖酰殼聚糖為載體，制備去甲斑蝥素N-乳糖酰殼聚糖納米粒(Norcantharidin Nlactose-chitosan nanoparticles，NCTD-GC-NPs)，去甲斑蝥素殼聚糖納米粒(norcant-haridin chitosan nanoparticles，NCTD-CS-NPs)并以H22 荷瘤小鼠為腫瘤模型動物，考察NCTD，NCTD-CS-NPs 及NCTD-GCNPs 在小鼠體內的抗腫瘤活性，實驗顯示，NCTDGC-NPs 在體內具有良好的肝靶向抗腫瘤活性;組織切片直觀反映出納米粒制劑尤其是乳糖酸殼聚糖納米可增強NCTD 對腫瘤的殺傷作用，表明去甲斑蝥素N-乳糖酰殼聚糖納米粒在體外可發揮雙重靶向作用，顯著提高藥物的抗腫瘤作用。

2.1.3 半乳糖修飾的NCTD 脂質體 脂質體作為藥物被動靶向的一種主要載體，經靜脈給藥后，主要被肝臟的非實質細胞所吞噬并進一步消除，極少到達肝實質細胞。采用受體介導實現脂質體的肝實質細胞靶向是一種非常有效的措施，其中半乳糖受體的研究最為廣泛和深入［24］。

姜華等［7］制備半乳糖衍生物修飾去甲斑蝥酸鈉脂質體(galactose norcantharidin liposomes，GNL)，以半乳糖為起始物，經乙酰化、溴代、縮合、置換后得化合物Galβ1-(CH2-CH2-O)2-C14-H29 作為修飾靶向材料，制備了去甲斑蝥酸鈉脂質體和GNL，利用RP-HPLC 測定小鼠尾靜脈注射給藥后小鼠肝臟中的藥物濃度。實驗表明脂質體表面經化合物Galβ1-(CH2-CH2-O)2-C14-H29 修飾后，GNL 肝臟靶向效率是去甲斑蝥酸鈉脂質體的1.8 倍，是去甲斑蝥酸鈉注射液的2.9 倍。由此說明在脂質體表面結合能被肝細胞特異識別的半乳糖苷，形成半乳糖受體介導的脂質體，有望成為更為理想的肝靶向藥物載體。

Lac-NCTD 的水溶性高，使其脂質體的包封率極低，直接影響了藥物的生物利用度。周奕等［25］將乳糖化-去甲斑蝥素與磷脂按一定配比，制備成乳糖化去甲斑蝥素磷脂復合物，旨在改善藥物的脂溶性進而提高其在體內的吸收，同時制備pH 敏感型脂質體可控制脂質體在腫瘤部位的釋放，從而提高藥效，降低毒性。

2.2 甘草次酸受體介導的NCTD 脂質體的研究

近年來，一種新型的肝特異性配基甘草皂苷及其苷元甘草次酸正在引起人們的關注［24］。Negishi證實了大鼠肝細胞膜上含有豐富的甘草次酸及甘草酸特異性結合位點［26］，隨后的研究也證實甘草次酸/甘草酸修飾的載體有趨肝性［27］。

吳超等［28］利用薄膜分散法制備甘草次酸衍生物甘草次酸硬脂醇酯-3-O-半乳糖苷(Stearin glycyrrhetinic acid ester-3-O-galactosidase，Gal-GAOSt)修飾去甲斑蝥素脂質體后，經小鼠尾靜脈給藥，采用HPLC 法檢測去甲斑蝥素在小鼠肝腎中的濃度隨時間的變化，與去甲斑蝥素水溶液組進行比較血藥濃度-時間曲線下面積(area under concentration-time curve，AUC)并以靶向指數TI=(AUC)NC-SOL/(AUC)Gal-GAOStNC-LP來判斷甘草次酸衍生物修飾去甲斑蝥素脂質體(Gal-GAOStNC-LP)對主要器官的靶向性。結果顯示，Gal-GAOStNC-LP 具有肝靶向性，并且被修飾的脂質體靶向性明顯，能提高藥物療效，降低毒副作用。

3 結語與展望

去甲斑蝥素單抗偶聯物，半乳糖介導的肝靶向前體藥物，半乳糖基修飾的納米粒及脂質體等，它們都不同程度地提高了肝靶向性，增加了藥物在肝腫瘤細胞中的濃度，降低了毒副作用，但也存在著一些需解決的問題，如不能口服，需注射給藥;載藥量有限，投放的藥物到達靶組織濃度低，難以達到足夠治療劑量等。這也促使人們尋找更佳的主動肝靶向載體，如新型的甘草次酸衍生物，膽酸等都可作為去甲斑蝥素主動肝靶向傳輸系統中的載體進行研究。相信通過廣泛深入的研究，有望開發出應用于臨床的主動肝靶向去甲斑蝥素藥物。

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