細胞支原體污染清除方法比較及清除后的應(yīng)用

（鄭州市兒童醫(yī)院 檢驗科，河南 鄭州 450000）

細胞支原體污染清除方法比較及清除后的應(yīng)用

錢錦

（鄭州市兒童醫(yī)院 檢驗科，河南 鄭州 450000）

目的 探討使用幾種支原體清除方法后，細胞支原體清除效果及所制備抗體應(yīng)用于相應(yīng)平臺的對比。方法 選用 4 種方法進行清除支原體。結(jié)果 通過 PCR 法鑒定，只有清除劑法及實體瘤法可清除支原體感染。結(jié)論 雜交瘤細胞清除支原體感染后，制備所得抗體應(yīng)用于相應(yīng)平臺可見，清除劑法對細胞損傷較大，抗體相應(yīng)功能下降；而實體瘤法教溫和，抗體相應(yīng)功能保持較完好。

支原體；雜交瘤細胞；抗體

支原體是一種大小僅為0.2～0.3 μm，無細胞壁，可透過一般過濾膜（0.22～0.45 μm）的原核生物。在細胞培養(yǎng)過程中，支原體感染發(fā)生率達到30%～60%，因而細胞培養(yǎng)過程中被支原體污染是一個世界性的難題[1]。當細胞（特別是傳代細胞）被支原體污染是很普遍的問題，做好支原體污染的防治工作，是保證實驗工作順利進行的重要一環(huán)[2]。細胞被支原體感染后，細胞內(nèi)的DNA、RNA及蛋白表達發(fā)生改變，而細胞的生長率一般并未發(fā)生顯著的影響，因而細胞被支原體污染一般難以察覺。當污染嚴重時，可導致細胞生長緩慢甚至凋亡。本文對傳代培養(yǎng)中的雜交瘤細胞污染支原體采用幾種方法進行清除試驗，將清除支原體后細胞進行制備抗體，應(yīng)用于相應(yīng)平臺，并取得一定效果。

1 材料與方法

1.1 材料：①試劑及動物：支原體污染檢測試劑盒購自上海依科賽（規(guī)格：MB000-1392；批號：120917）支原體清除劑Myco-1 Myco-2 Myco-3購自Applichem公司（貨號及規(guī)格A5222_0020；A5233_0020及A5240_0020），RPMI 1640培養(yǎng)基（規(guī)格及批號：10X1L，批號1146563），胎牛血清（FBS 規(guī)格及批號：500ML，210170K）購自Gibco公司；所用化學試劑均為國產(chǎn)分析純；實驗室用水為超純水；雜交瘤細胞株AFP （抗甲胎蛋白單克隆抗體）2-8F9及1-12A5為本實驗室傳代保存；SPF級BALB/c純系小鼠，鼠齡 6～8周，體質(zhì)量 18～22 g，由中山大學實驗動物中心提供。②儀器：Bio-red 公司MJ-MINI PCR擴增儀；DYY-6C型電泳儀為上海京工實業(yè)有限公司產(chǎn)品，BB15性CO2培養(yǎng)箱為美國Themo公司產(chǎn)品，TGW16型離心機為長沙英泰公司生產(chǎn)；眼科剪，眼科鑷，200目篩網(wǎng)等購自海門鴻銳。

1.2 支原體檢測方法：應(yīng)用上海依科賽公司開發(fā)的支原體檢測試劑盒（PCR快速檢查法）檢測細胞支原體感染情況。

1.3 支原體污染清除方法：①小鼠體內(nèi)（腹腔）誘生法：經(jīng)鑒定有支原體污染的雜交瘤細胞 2-8F9及1-12A5 各2×106個1200 rmp 離心5 min， 2 mL無菌生理鹽水復懸，腹腔注射4只B/C小鼠。10～14 d無菌收腹水，離心，雜交瘤細胞復懸于1640完全培養(yǎng)基中，移入24孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，第2天換液，細胞生長至24孔底60%以上檢測效價，腹水及細胞上清均轉(zhuǎn)為陰性，棄用次法。②小鼠體內(nèi)（皮下實體瘤）誘生法：經(jīng)鑒定有支原體污染的雜交瘤細胞 2-8F9及1-12A5 各5×105個1200 rmp 離心5 min，0.5 mL無菌生理鹽水復懸，各注射2只B/C小鼠皮下，20 d左右無菌回收實體瘤，于200目篩網(wǎng)研磨，離心，雜交瘤細胞復懸于1640完全培養(yǎng)基中，移入24孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，第2天換液，細胞生長至24孔底 60%以上檢測效價，無明顯下降，重復2次以上皮下實體瘤。③亞克隆法：常規(guī)方法取小鼠腹腔飼養(yǎng)細胞，稀釋至大約1×106個/mL，加入96孔細胞板，每孔0.1 mL，將雜交瘤細胞2-8F9及1-12A5各100個種入一塊96孔細胞板中，4～5 d換液，7～8 d檢測效價，效價略降，篩選單集落亞克隆，重復3次。④抗生素法（支原體清除劑法）：使用含支原體清除劑 1% Myco-3 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)有支原體污染的雜交瘤細胞 2-8F9及1-12A5，3天換液1次，連續(xù)培養(yǎng)14 d，雜交瘤細胞存在輕度污染，繼續(xù)使用同系列支原體清除劑1% Myco-1 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d后換1%Myco-2 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，交替使用3個循環(huán)，每周檢測效價，無明顯下降。

2 結(jié)果與分析

2.1 處理方法比較：采用前面介紹的幾種方法處理細胞以期達到清除支原體污染，但是在幾種處理污染細胞的方法比較中發(fā)現(xiàn)，細胞會有不同程度的損傷，見表1。

表1 細胞支原體污染去除方法比較

2.2 細胞上清效價比較：在比較細胞損傷及清除污染的同時，對于分泌抗體的雜交瘤細胞，我們還需要重點關(guān)注支原體去清除的同時是否改變的細胞原有的生物性質(zhì)，即其分泌抗體的能力是否發(fā)生改變。圖1是四種不同方法去除污染后細胞上清分泌抗體功能的比較。

從圖1中我們可以看到四種處理方法中實體瘤方法處理后細胞分泌抗體的能力與為感染前的較一致，支原體清除劑處理后細胞上清的OD值低0.2左右，亞克其次，腹腔處理方法細胞分泌抗體的功能基本丟失。

2.3 抗體應(yīng)用：對于細胞分泌抗體功能仍然保留較完整的細胞，我們擴大培養(yǎng)，處理后的細胞進一步制備抗體，抗體評價細胞分泌的抗體活性應(yīng)用情況。圖2是處理前后純化得到的抗體效價比較。

從圖2-1可看到2-8F9污染前及實體瘤處理后所得抗體效價相當，抗生素處理后所得抗體效價遠低于污染前抗體效價；圖2-2可看到1-12A5污染前，實體瘤處理和抗生素處理后所得抗體效價相當。

抗AFP單克隆抗體 2-8F9 作包被材料應(yīng)用于膠體金平臺，抗AFP單克隆抗體 1-12A5 作T線包被材料應(yīng)用于熒光定量平臺進一步評價抗體性能是否發(fā)生改變，見表2和圖3。

從表2可看到污染前及處理后細胞株2-8F9所制備抗體應(yīng)用于膠體金平臺，不同包被濃度，抗生素處理的檢測值均比實體瘤處理及污染前低3個梯度以上，實體瘤處理和污染前檢測值相當?？笰FP單克隆抗體 1-12A5 作T線包被材料應(yīng)用于熒光定量平臺。抗體包被濃度為1.0 mg/mL，AFP濃度（ng/mL）為：14.22、41.36、81.51、161.3、434.3的熒光檢測結(jié)果見圖3。

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：1671-8194（2014）30-0069-02