蝮龍抗栓丸聯合骨髓干細胞移植對大鼠缺血再灌注腦損傷的作用

（沈陽市第二中醫醫院，遼寧 沈陽 110101）

蝮龍抗栓丸聯合骨髓干細胞移植對大鼠缺血再灌注腦損傷的作用

鄧秀君

（沈陽市第二中醫醫院，遼寧 沈陽 110101）

目的 本研究比較骨髓單個核細胞（BMSC）、骨髓間充質干細胞（BMNC）蛛網膜下腔移植以及中藥蝮龍抗栓丸聯合的方法治療缺血再灌注腦損傷（MCAO）大鼠。移植后 4、28 d 神經功能損傷后的恢復情況。方法 將分離純化的 BMSC 和 BMNC 以蛛網膜下腔注射的方法移植到缺血再灌腦損傷大鼠顱內，同時進行中藥聯合治療。移植后 4、28 d 評定大鼠神經功能損傷恢復情況。結果 與治療后第4 天相比，?？战M和各治療組在治療干預后第 28 天 MMNSS 神經功能評分降低均具有統計學意義。結論 以相同劑量的細胞進行移植，骨髓間充質干細胞對神經功能的修復作用更好，中藥聯合骨髓間充質干細胞移植對缺血性腦梗死神經功能障礙的修復具有協同作用。

中藥；骨髓間充質干細胞；骨髓單個核細胞；大腦中動脈梗死；蛛網膜下腔；細胞移植；神經功能評分

腦血管病（cerebrovascular disease，CVD）以高發病率、高致殘率、高病死率成為嚴重威脅人類健康的重大疾病[1]。本研究分別應用骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）和骨髓單個核細胞（bone marrow mononuclear cells，BMNC）于蛛網膜下腔移植以及中藥蝮龍抗栓丸聯合的方法治療缺血再灌注腦損傷（MCAO）大鼠。于移植后4、28 d應用NSS神經功能評價量表，評定MCAO大鼠的神經功能損傷后的恢復情況。分析和評價了相同劑量、不同種類的同種異體骨髓源干細胞移植在促進缺血性腦梗死大鼠神經功能修復能力方面的差異，同時比較了單純骨髓干細胞移植和中藥與骨髓干細胞移植聯合治療方法之間的療效差異，篩選了更加適宜的中西醫聯合治療實驗方案。進而為探討骨髓源干細胞移植，以及中藥聯合骨髓源干細胞移植治療缺血性腦血管病的作用研究提供了可靠的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：Wistar大鼠SPF/VAF級雄性（北京維通利華實驗動物技術有限公司），共計150只。其中，3～4個月齡，（280±20）g，140只；3～4周齡，70～90 g，10只。主要試劑：培養基L-DMEM、胎牛血清、0.25%胰酶（均來自美國GIBCO公司）；5’-溴脫氧核苷尿嘧啶（武漢博士德公司）；大鼠淋巴細胞分離液（中國醫學科學院生物工程研究所）；蝮龍抗栓丸（沈陽市蘇家屯區中醫醫院）主要成分為天麻、菖蒲、黃芪、丹參、川芎、蝮蛇等。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組與干預方案：取3～4個月的Wistar雄性大鼠，140只，隨機分成7組，每組20只。分別為正常組、假手術組、模空組、BMNC組、中藥聯合BMNC組、BMSC組、中藥聯合BMSC組。術后24 h進行蛛網膜下腔細胞移植和中藥灌胃，直至4、28 d取材。

1.2.2 骨髓源干細胞的分離和培養：取3～4周齡Wistar雄性大鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉，無菌條件下取出股骨、脛骨。剪開股、脛骨兩端，用4 ℃PBS反復沖洗骨髓。離心，收集中間的單個核細胞層。用含10%胎牛血清L-DMEM細胞培養液培養，置于37 ℃，5%CO2培養箱，飽和濕度條件下培養。24 h后更換新培養液，去除未貼壁細胞，以后每3天換液1次。顯微鏡下觀察細胞生長達到80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化備用。

1.2.3 大鼠缺血再灌腦損傷模型建立：動物造模采用Zea Longa改良線栓法[1]，建立大鼠大腦中動脈栓塞2 h再灌注模型（middle cerebral arterial occlusion，MCAO）。選擇3～4個月齡雄性Wistar大鼠，腹腔內注射10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉后，仰臥固定。鈍性分離暴露右側頸總動脈（CCA），頸外動脈（ECA），頸內動脈（ICA），結扎CCA，在根部結扎ECA，在CCA近頸內、頸外分叉處剪一小口，將末端燒成圓頭的4 cm的尼龍線順勢緩慢送入ICA，深度約為（18±2）mm，結扎ICA，在MCA起始端堵塞MCA的血流。血流阻閉2 h后，抽出尼龍線，恢復灌注。麻醉蘇醒后，mNSS評分在6分以上的大鼠為造模成功。假手術組大鼠操作至暴露ICA、ECA后簡單剝離即縫合，其余處理同手術組。正常組不處理。

1.2.4 BMSC或BMNC的蛛網膜下腔移植：MCAO模型鼠造模24 h后，異丙酚尾靜脈麻醉，然后枕骨大孔處將BMSCs或BMNCs制成的細胞懸液，以1 μL/min進行蛛網膜下腔注射，?？战M以0.01 MPBS代替。移植的細胞總數約為2×107個，體積為100 μL。注意速度要慢，以防MCAO動物顱內壓過高，導致死亡。

1.2.5 大鼠神經功能的評定：采用NSS綜合評價各組大鼠在腦缺血再灌注損傷后的神經功能。主要觀察大鼠的運動、感覺、平衡、神經反射和總體表現，進而系統評價神經系統損傷的嚴重程度。分別于治療干預4、28 d對各實驗組大鼠予以相應的神經功能評定。

2 結 果

實驗大鼠于手術中呼吸、體溫維持在正常生理范圍，造模術后2～3 h大鼠可蘇醒，創口無活動性出血。140只實驗大鼠，造模手術死亡9只，評分不符合標準剔除7只，灌胃死亡2只，足趾損傷3只（考慮造模導致患側足部感覺異常，大鼠自行咬傷，予以剔除），最終納入統計分析的標本數共計114只，平均每組16只。MCAO造模后，大鼠反應和精神狀態較差，多臥少動，毛色晦暗、蓬亂，體質量逐漸下降，3～7 d后逐漸開始逐漸恢復。以?？战M表現較典型，細胞組及中藥聯合治療組大鼠一般狀態及體質量恢復較快。

神經功能評分（mMMNSS量表）結果：采用神經功能損傷量表（mMMNSS）綜合評價各組大鼠在腦缺血再灌注損傷后的神經功能。MCAO術后24 h評分在6分以上者可進入本實驗研究，其余剔除。治療干預4、28 d實驗大鼠神經功能評分見表1，各組4、28 d實驗大鼠神經功能評分對比見表1。

各組實驗大鼠神經功能評分結果說明，治療干預后第4天：與模型組比較，BMNC組和中藥聯合BMNC組MMNSS神經功能評分變化無統計學意義（P＞0.05），BMSC組和中藥聯合BMSC組MMNSS神經功能評分降低具有統計學意義（P＜0.05）；與BMNC組比較，中藥聯合BMNC組MMNSS神經功能評分變化無統計學意義（P＞0.05），BMSC組和中藥聯合BMSC組MMNSS神經功能評分降低具有統計學意義（P＜0.05）；與BMSC組比較，中藥聯合BMSC組MMNSS神經功能評分降低有統計學意義（P＜0.05）；與中藥聯合BMNC組比較，中藥聯合BMSC組MMNSS神經功能評分降低有統計學意義（P＜0.05）。

表1 4、28 d各組大鼠神經功能評分（xˉ±s）

治療干預后第28天：與模型組比較，BMNC組MMNSS神經功能評分變化無統計學意義（P＞0.05），中藥聯合BMNC組、BMSC組和中藥聯合BMSC組MMNSS神經功能評分降低具有統計學意義（P＜0.05）；與BMNC組比較，中藥聯合BMNC組、BMSC組和中藥聯合BMSC組MMNSS神經功能評分降低具有統計學意義（P＜0.05）；與BMSC組比較，中藥聯合BMSC組MMNSS神經功能評分變化沒有統計學意義（P＞0.05）；與中藥聯合BMNC組比較，中藥聯合BMSC組MMNSS神經功能評分變化沒有統計學意義（P＜0.05）。

與治療后第4天相比，模空組和各治療組在治療干預后第28天MMNSS神經功能評分降低均具有統計學意義。

3 討 論

3.1 骨髓源干細胞的移植時機和劑量

移植動物實驗對最佳移植時間進行了大量的研究，從腦梗后1、7、14、30 d等[2-5]均有相關的研究。并且移植后動物神經功能都有一定程度的改善。動物實驗關于BMSCs治療腦梗死細胞劑量研究較多。目前比較認同的細胞劑量是1×106[6]。

3.2 中藥復方聯合骨髓干細胞移植對MCAO大鼠神經功能修復的影響

缺血性腦梗死屬中醫“中風”范疇，其病機復雜，以氣虛血瘀，風火夾痰濁夾瘀，痹阻脈絡為主要病機。中藥復方蝮龍抗栓丸以“益氣活血、熄風化痰、化瘀通絡“為治法，對缺血性中風發揮治療作用[7]。諸藥協同發揮改善腦內血液循環，調節中樞神經系統功能，調節免疫和炎癥等作用。動物實驗和臨床觀察表明，蝮龍抗栓丸治療腦梗死的效果肯定[7]，可顯著改善患者的生存質量。

中藥對BMSC的影響可以概括為促進BMSCs的生長、增殖、分化，改變其分泌狀態以及保護分化后的神經細胞等多個環節[8]。近年來漸有中醫藥在骨髓間充質干細胞移植治療腦缺血損傷影響方面的報道，但研究多集中于對其體外的誘導分化方面，所選藥物以單味中藥或提取物為主，而中藥復方對BMSC移植后體內細胞因子代謝方面的研究少見。中藥對移植后微環境的調控對MSCS存活、遷移、分化[9]，以及恢復神經組織的結構和功能具有重要意義。BMSCS屬于移植物，其移植后能否很好地存活、整合于病變部位，與其他神經元建立神經通路是移植細胞修復神經功能的基礎[10]。BMSCs移植后腦內微環境在其存活、遷移和分化中具有重要作用。移植后腦內微環境主要由神經營養因子、炎性因子等構成，中藥調控神經營養因子、炎性因子等微環境變化對BMSC移植治療腦缺血損傷具有重要意義[11]。

本研究發現，腦缺血再灌注可引起大鼠急性神經功能損傷，早期損害較嚴重，隨著時間推移大鼠對神經損傷自愈有能力，28 d時損傷的神經功能較急性期已有明顯恢復，僅存留輕度神經功能障礙。說明MCAO大鼠對神經損傷具有自愈能力。與模型組相比，BMSC組、中藥聯合BMSC組于移植早期（4 d）和后期（28 d）能夠明顯改善MCAO大鼠神經功能評，且早期以中藥聯合治療效果更顯著，提示中藥聯合應用可以協同提高骨髓間充質干細胞對腦缺血性梗死治療的早期效果。而骨髓單個核細胞對MCAO大鼠神經功能障礙修復功能在早期和后期始終未能體現出優于自然恢復的治療效果。中藥聯合骨髓單個核細胞治療在早期亦未見療效，于移植后28 d方顯示出神經功能改善作用。接受移植的MCAO大鼠覓食、行為活動等習性未見異常改變，無脫毛、發熱、腹瀉、出血及免疫排斥現象。

4 結 論

本研究結果提示：①同種異體骨髓間充質干細胞移植對成年大鼠未產生不良反應；②以相同劑量的和骨髓單個核細胞進行移植，骨髓間充質干細胞對神經功能的修復作用更好；③中藥的聯合骨髓間充質干細胞移植對缺血性腦梗死神經功能障礙的修復具有協同作用。

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R285.5；R743.3

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