黃體酮注射液無菌檢查方法的改進及驗證

（廣西柳州食品藥品檢驗所，廣西 柳州 545006）

黃體酮注射液無菌檢查方法的改進及驗證

韋永樸

（廣西柳州食品藥品檢驗所，廣西 柳州 545006）

目的 對黃體酮注射液無菌檢查方法進行改進并驗證。方法 按《中國藥典》2010 年版二部無菌檢查法的有關要求，采用封閉式薄膜過濾器過濾，最后用大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉對所采用的方法進行驗證。結果 黃體酮注射液采用封閉式薄膜過濾器進行無菌檢查，所用的各驗證菌均生長良好。結論 改進后的方法重現性好，穩定、可靠，可作為黃體酮注射液的無菌檢查方法。

黃體酮注射液；無菌檢查；方法改進及驗證

黃體酮注射液為黃體酮的滅菌油溶液，收載于《中國藥典》2010年版二部，臨床常肌內注射，用于月經失調，如閉經和功能性子宮出血、黃體功能不足、先兆流產和習慣性流產（因黃體不足引起者）、經前期緊張綜合征的治療[1]。根據其制法和給藥途徑，按《中國藥典》2010年版二部要求應進行無菌檢查[1]。近年來我們在廣西柳州、來賓2市轄區內抽驗的國家基本藥物中發現，生產黃體酮注射液產品的生產企業所提供的無菌檢查方法是直接接種法（即按藥典無菌檢查要求取樣品直接加入含有1%聚山梨酯80的培養基中），按該方法操作時，存在以下弊端：①由于培養管和硅膠塞密封性不很理想，培養過程中易染菌；②樣品不溶于水，浮于培養基上，在培養基表面形成一層膜，易產生厭養境況，不利于需養菌生長，易誘發假陰性可能；③不符合《中國藥典》2010年版二部附錄Ⅺ H無菌檢查法提出“只要供試品性狀允許，應采用薄膜過濾法”[1]的要求。本文改用薄膜過濾法，采用封閉式薄膜過濾器進行試驗及方法驗證，結果符合《中國藥典》2010年版二部附錄Ⅺ H無菌檢查法有關規定，方法穩定、可靠。

1 實驗試藥、儀器及設施

1.1 樣品

黃體酮注射液，浙江仙據制藥股份有限公司生產，批號：110403、100911、110306由本單位業務室提供。

1.2 實驗菌種

大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]、生孢梭菌[CMCC（B）64941]、白色念珠菌[CMCC（F）98 001]、黑曲霉[CMCC（F）98 003]均由本單位生測室提供。

1.3 培養基

硫乙醉酸鹽流體培養基、改良馬丁培養基、營養肉湯培養基、改良馬丁瓊脂（均由北京三藥科技開發公司生產）。

1.4 稀釋劑

pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.9%無菌氯化鈉溶液。

1.5 儀器及設施

封閉式集菌培養器（PY330、PY220）、智能集菌儀、電子天平、電熱恒溫培養箱、生化培養箱、生物安全柜、高壓滅菌鍋、旋渦混合器、電熱干燥箱、環境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區域等。

2 方法和結果

2.1 菌液制備

接種大腸埃希菌[CMCC（B）44 102] 第3代、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]第3代、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]第3代的新鮮培養物至營養肉湯培養基，33 ℃培養18～24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，25 ℃培養培養48 h。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含50～100 cfu的菌懸液；接種生孢梭菌[CMCC（B）64941] 第3代新鮮培養物至硫乙醉酸鹽流體培養基33 ℃培養18～24 h；用硫乙醉酸鹽流體培養基制成每1 mL含50～100 cfu的菌懸液；接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基，25 ℃培養7 d，加入10 mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含孢子50～100 cfu的孢子懸液。備用[2,3]。

2.2 供試液制備

取供試品30支，加入約100 mL含有1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中充分混合，制成供試液。

2.3 方法及驗證

取上述供試液用杭州泰林生物技術設備有限公司生產的PY330全封閉集菌培養器，經智能集菌儀進行過濾，抽干，再用100 mL含有1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，濾凈，然后每個培養器內灌注100 mL硫乙醇酸鹽流體培養基，同法制成改良馬丁培養基2管，上述5管作為試驗組；另取3個兩聯集菌培養器，每個直接灌注100 mL培養基（硫乙醇酸鹽流體培養基3管，改良馬丁培養基2管），作為陽性對照組。然后上述兩組分別加入＜100 cfu的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉每間組各一管；另取一個兩聯集菌培養器，取20 mL稀釋劑代替供試液按上述方法同法操作，過濾抽干后，一管加入100 mL硫乙醇酸鹽流體培養基，另一管加入100 mL改良馬丁培養基，做為陰性對照。最后把各硫乙醇酸鹽流體培養基集菌培養器置于33 ℃的電熱恒溫培養箱培養3 d，把各改良馬丁培養基集菌培養器置于25 ℃的生化培養箱培養5 d，觀察結果見表1。

表1 實驗驗證結果的比較

從上述3個批號樣品的驗證試驗結果看，6種驗證菌在試驗組及陽性對照組中均生長良好，符合《中國藥典》2010年版二部附錄Ⅺ H的要求，方法可行。

按上述擬定的黃體酮注射液無菌檢查方法，對三批樣品進行檢驗，以考查該方法的可靠性及重現性，結果見表2。

3 討 論

表2 樣品檢驗結果的比較

試驗結果表明：改進后的方法完全符合《中國藥典》2010年版二部規定的無菌檢查法的要求，方法穩定、可靠。可避免直接接種法存在的各種隱患，可作為該產品的質量控制方法。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版.二部[S].北京:中國醫藥科技出版社,2010.

[2] 中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規范[M]. 2010年版.北京:中國醫藥科技出版社,2010.

[3] 馬緒榮,蘇德模.藥品微生物學檢驗手冊[M].北京:科學出版社, 2000.

Method Study to Improve The Method for Sterility Test of Progesterone Injection

WEI Yong-pu
(Liuzhou Food and Drug Control in Guangxi Zhuang Autonomous Region, Liuzhou 545006, China)

Objective A method study to improve the method for sterility test of progesterone injection. Methods According to the sterility test in Chinese Pharmacopoeia(2010 edition, VolumeⅡ), filter with the enclosed membrane filter, and using the Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Clostridium Sporogenes, Candida albicans, Aspergillus niger to verifying the method that is uesed. Result Adopt the enclosed membrane filter to do the sterility test of progesterone injection, and all the verification bacteria grow well. Conclusion This improved method is stabilization, credibility, reproducible and suitable for the sterility text of progesterone injection.

Progesterone injection; Sterility test; Method improvement

R927

：B

：1671-8194（2014）30-0033-02