15N示蹤法測定海洋反硝化速率中29N2濃度的準確定量

曾健，陳敏，2＊，鄭敏芳，邱雨生，2

（1.廈門大學 海洋與地球學院，福建 廈門 361005；2.近海海洋環境科學國家重點實驗室，福建 廈門 361005）

1 引言

固氮速率和反硝化速率的相對平衡，決定了海洋無機氮儲庫的大小，直接影響著海洋生態系統的生物泵效率乃至海洋吸收大氣CO2的能力［7］。諸多古海洋沉積記錄已證明，在地質歷史時期，海洋的固氮作用和反硝化作用相對強弱發生著周期性的變化［8—10］，并且與地球氣候的波動密切相關［3，11—12］。學術界對現代海洋固氮速率和反硝化速率是否平衡一直存在很大爭議［4，13—17］，這也使得海洋氮循環成為備受關注的熱點之一。目前的研究結果認為，海洋由反硝化作用遷出的結合態氮通量達到400Tg/a左右［15，18—19］，而海水的反硝化速率約為100Tg/a［9，18］，且主要集中在阿拉伯海和東赤道南、北太平洋等三大氧極小值區［18］。然而，近年來厭氧氨氧化作用及其他新型脫氮過程的發現，極大地改變了有關海洋氮循環的傳統認識［20—21］，也使得反硝化作用在海洋中的主導地位面臨挑戰［22—25］。因此，準確評估海洋反硝化作用的強度以及相關的調控因素，有助于深入了解現代海洋的氮循環路徑。

基于15N示蹤的同位素配對技術（Isotope Pairing Technique，IPT），因其快速、靈敏的特點［26］，尤其能夠定性和定量區分反硝化和厭氧氨氧化過程而被廣泛應用于海洋氮循環研究中［27—30］，也是目前最重要的技術手段之一。N2是反硝化作用的最終產物，也是分析測試的對象。由于環境中的空氣具有很高的N2含量，因此，避免樣品被空氣污染是準確定量獲得反硝化速率的關鍵。15N示蹤測定反硝化速率的實驗過程中，涉及到趕氣、水樣轉移、示蹤劑添加、樣品存放等一系列流程，這些都很難避免不會受到空氣背景的污染［31］。尋找一種能夠有效校正空氣背景影響的方法，對于準確定量反硝化速率尤為重要。本研究通過對南海海水反硝化速率測定過程中所獲得的N2及其同位素組成的數據進行分析，探索測定過程中空氣的N2背景是否對實測結果產生了影響，進而提出了校正空氣29N2背景影響的方法，通過對實際海水樣品的分析，驗證所提出校正方法的可行性。

2 材料與方法

2.1 樣品采集

2012年8—9月期間，搭載“實驗3號”科學考察船，采集南海中心海盆（10°～18°N，110°～118°E）300～1 500m深度區間的海水，運用15N標記示蹤的同位素配對技術開展反硝化速率的測定。為避免采樣過程中的空氣污染，本實驗在鄭敏芳［32］研究的基礎上加以改進，即由CTD－Rossett采水器采集的海水先用乳膠管引出并注入到250cm3玻璃瓶內［33］，乳膠管的出水口始終保持在液面下方1cm左右處，待水樣溢流3倍采樣瓶體積后，旋緊瓶蓋，在室溫下避光存放。每個層位采集了雙份平行樣。

2.2 水樣的趕氣和轉移

對每個層位所采集的兩份水樣分別進行預先趕氣和不趕氣處理［32］。取其中一份水樣，將一支通有高純He氣（純度99.999%）的15cm長不銹鋼針穿過帶硅膠墊的瓶蓋插至瓶底，同時在硅膠墊上扎一個小針頭以排出空氣，吹掃30min。將吹掃、趕氣后的水樣通過高壓He氣轉移至10支預先用高純He氣吹掃過的12.5cm3帶橡膠墊密封培養瓶內（Labco Exetainer，Wycombe，UK），頂空部余留4cm3體積。另一份水樣不做高純He預先的趕氣處理，以相同的方法轉移至10支密封的培養瓶內。所采用的這種培養瓶也是目前國內外研究中最為廣泛采用的培養瓶［23—30，32—33］。

2.3 水樣的培養實驗

用微量進樣針將0.06μmol K15NO3（15N 原子豐度98.50%，上海化工研究院）溶液加入各培養瓶內，使得培養體系中15N的豐度約為20%，此過程培養瓶始終保持密封。每個層位的水樣均設置5個培養時間段，即0h、48h、72h、96h和120h，每個時間段的樣品設置了雙份平行樣。在培養的終點，用10μm3飽和HgCl2溶液抑制生物的活性。所有樣品均在采樣后3h之內完成培養前的處理，且都在室溫下的無光的水槽中進行。培養結束后，樣品倒置在室溫水槽內密封存放，帶回陸地實驗室進行N2濃度及其同位素組成的分析。

2.4 N2及其同位素組成的質譜分析

采用Gas BenchⅡ自動進樣器與DELTAPlusXP穩定同位素比值質譜儀（Thermo Finnigan，USA）聯機方式對樣品 的28N2、29N2和30N2同 時 進行測定。分析測試前，先對樣品進行加熱（40℃）超聲處理40min［32］，將溶解在海水中的N2完全驅趕至培養瓶的頂空部，之后進樣進行測定。樣品從采集到分析間隔1個月左右的時間。分析時采用空氣為標準進行測量，本研究中N2濃度測定的相對標準偏差小于8%［32］。

2.5 反硝化速率的計算

在一個僅存在反硝化作用的培養體系中，加入15N示 蹤 物 后，會 產 生28N2、29N2和30N23種質量數的N2。假設反硝化細菌隨機利用體系中的14N和15N，那么由生物產生的這3種分子之間的比例關系與溶液中15N的豐度（即15N濃度占體系N總濃度的份額，用FN表示）有關［32，34］，可表示為：

因此，通過測定29N2、30N2分子的產生速率，即可計算反硝化速率［33，35］：

其中，Rdeni、R29和R30分別代表反硝化速率、29N2產生速率以及30N2產生速率。后兩者可通過對不同培養時間 段 產 生 的29N2和30N2濃 度 做 線 性 擬 合 得到［23—24］。

3 結果與討論

3.1 29N2、30N2與28N2峰面積的比較

將所有實驗數據的29N2峰面積（Area 29）和30N2峰面積（Area 30）分別對28N2峰面積（Area 28）作圖，發現這些數據點均落在一條直線的上方。若進一步將這些數據分為3組：（1）未經趕氣處理且不存在反硝化作用的樣品；（2）經過趕氣處理但不存在反硝化作用的樣品；（3）存在反硝化作用的樣品，則可明顯看出，前兩組樣品的數據都落在一條直線上，而存在反硝化作用樣品的數據則離散地分布在直線上方（圖1）。對于不存在反硝化作用的樣品，將未經趕氣和經趕氣處理的Area 29和Area 28分別進行擬合，可得其關系分別為y＝0.007 29x＋0.003（r2＝0.998 9，n＝34）和y＝0.007 35x＋0.000 04（r2＝0.999 9，n＝152）；同樣地，對這兩組樣品 Area 30和 Area 28進行線性擬合得到的結果分別為y＝0.003 44x－0.021（r2＝0.920 0，n＝34）和y＝0.002 81 x－0.004（r2＝0.971 1，n＝152）。上述擬合結果說明，在沒有反硝化作用發生的情況下，水樣中所溶存氮氣的29N2/28N2組成相當恒定，且趕氣和未經趕氣處理的樣品之間29N2/28N2組成幾乎沒有差異（偏差小于1%），而未經趕氣處理的樣品30N2/28N2比值比趕氣處理的30N2/28N2比值來得高，相對偏差大于20%。此前不同學者對采自全球不同區域的大氣樣品進行過分析，結果表明，空氣中 N2的15N/14N 比 值 幾 乎 恒定。Junk和Svec對5份來自全球不同海拔地區的空氣樣品進行了 分 析，其29N2/28N2比 值 平 均 為 0.007 351±0.000 001［36］；Mariotti于不同季節對環法國17個地區的空氣樣品進行分析后指出，δ15N標準偏差小于0.03×10－3，即15N相對豐度的偏差小于1×10－5［37］，說明大氣的15N/14N比值隨時間和空間的變化很小。Berglund和Wieser為國際純粹與應用化學聯合會（IUPAC）撰寫的“元素同位素組成2009”報告中進一步確定了大氣中15N相對豐度最理想的測試結果為0.366 3%，換 算 成29N2/28N2的 理 論 比 值 即 為0.007 35［38］。結合本研究結果，可以確定空氣中29N2/28N2的比值恒定為0.007 35。

3.2 水樣中N2和30N2峰面積過剩的來源分析

圖1 29 N2、30 N2 和28 N2 峰面積的關系

空 氣 中15N 的 豐 度 為 0.366%［39—41］。假 設 N2由15N和14N原子隨機組合形成，根據理論計算，空氣中29N2/28N2的比值應為0.007 35，而30N2/28N2的比值應為0.000 013 5。比較發現，不存在反硝化作用的樣品中溶解氣體的29N2/28N2比值與空氣的29N2/28N2理論比值幾乎完全一致，但不存在反硝化作用實測樣品的30N2/28N2比值卻較空氣的理論值高出2個數量級。在一個15N豐度為20%的培養體系中，若存在反硝化作用，假設細菌隨機利用14N和15N，且不考慮同位素分餾效應，那么實際產生的29N2/28N2和30N2/28N2比值應分別為0.5和0.062 5，均遠大于上述實測值。若培養體系中存在厭氧氨氧化作用，由于該過程不產生30N2，故會導致30N2/28N2比值的降低，而不是升高［27］。基于上述考慮，可以排除生物過程產生過剩30N2的可能性。

為進一步證實這些水樣溶解的N2來自于大氣，取以往不同時間利用實驗周圍空氣所做的標準工作曲線進行對比，可發現實測得的29N2/28N2比值平均為（0.007 33±0.000 03），與理論值幾乎吻合；而實測得的30N2/28N2比值平均為（0.001 50±0.000 51），同樣較理論值高出2個數量級，但略低于上述樣品的測定值（圖2）。由此可以說明，研究樣品中確有空氣殘留的N2存在，而且這部分來自于空氣的N2具有30N2顯著“過剩”的特征。水樣中殘留的N2可能由于趕氣不充分或者是樣品存放過程中外界空氣的擴散進入。鄭敏芳［32］曾仔細探索過趕氣過程去除培養瓶N2的效率，結果表明當趕氣時間超過10min后，培養瓶內N2濃度低于檢測限，因此水樣中殘留的N2更可能是在樣品長時間存放期間外界空氣的擴散進入。由于實測空氣的29N2/28N2比值與樣品測得的29N2/28N2比值十分接近，說明在外界空氣擴散進入培養瓶時，并未導致28N2和29N2的明顯分餾。

如此，樣品和空氣中“過剩”30N2的存在是否是其它組分干擾的結果？30N2被質譜的離子源轟擊后產生30N離子，核質比m/e為30。近些年的研究表明，N2O分子被質譜離子源的電子轟擊后會產生NO＋碎片，且與N2O＋離子個數有恒定的比例關系［42］。氮、氧 元 素 分 別 以14N（99.637%）和16O（99.757%）豐度最高，故 m/e為30的14N16O＋是主要碎片。空氣中 N2O的含量約為300×10－9［43］，與 N2含量的比值為4×10－7；海水中溶解N2O平均濃度小于50nmol/kg［43］，僅相當于溶解 N2濃度（500μmol/kg）的萬分之一，顯然，即使樣品或空氣中存在N2O，也無法支持所觀察到的30N2過剩現象。除N2O以外，天然海水或空氣中存在的分子量為30的氣體還包括14N16O、13C17O和12C18O，但它們的含量均遠小于N2含量的百萬分之一［40］，也不可能是產生30N2過剩的主要原因。就目前認識，尚無法清晰界定所觀察到的30N2過剩來源，有待后續更深入的研究。鑒于30N2存在未知來源的額外影響，本研究在反硝化速率的計算中僅采用29N2測值進行計算，同時重點考慮培養體系中空氣29N2背景的校正方法。

圖2 不同時間空氣 N2 中29 N2、30 N2 和28 N2 的關系

3.3 29N2峰面積測定結果的校正

根據上述討論可知，經過培養的水樣或者由于趕氣不夠充分，或是因為存放期間外界空氣的擴散進入，導致樣品中產生了N2背景，這勢必會對反硝化速率的計算結果產生影響。幸運的是，這部分N2具有恒定不變的29N2/28N2比值，故可利用這一特征信號，對實測的29N2峰面積進行校正，從而準確獲得經反硝化作用產生的29N2峰面積。

根據空氣N2和反硝化作用所產生N2的29N2/28N2比值特征，可建立兩種方法來區分反硝化作用與空氣對N2的貢獻：

方法一：培養后水樣中的N2包含生物反硝化作用產生和空氣N2背景兩部分。設由生物反硝化作用產生的28N2、29N2峰面積分別為a1、b1，空氣 N2背景的28N2、29N2峰面積分別為a2、b2；實測的28N2和29N2峰面積分別為A和B。由于空氣N2背景中28N2占絕對主導地位，故可假設生物反硝化作用產生的28N2相比于背景可忽略（即a1＝0）。另外，由上述討論可知，b2/a2為一恒定比值，用β表示（β＝0.007 35）。由此，可獲得如下質量平衡關系：

求解b1得：

方法二：若考慮生物作用貢獻的28N2，在不存在厭氧氨氧化作用的條件下，假設反硝化細菌在培養體系中隨機利用14N和15N，且忽略同位素分餾效應，那么由反硝化作用產生的29N2/28N2峰面積比值等于2FN/（1－FN）［34］，用α表示，FN為體系中15N/14N豐度比。同樣，可建立如下質量平衡方程：

求解b1得：

將兩種校正方法得到的b1值進行對比，發現二者所得數據十分吻合（圖3）。這個結果也恰好說明上述兩種方法所對應的假設前提在實際培養體系中可以成立，即：（1）由生物反硝化作用產生的28N2與空氣的28N2背景相比可以忽略；（2）研究樣品不存在厭氧氨氧化作用；（3）反硝化作用的同位素分餾效應在計算過程中可以忽略。因此，對于只存在反硝化作用的天然水體，利用15N標記示蹤法測定反硝化速率時，可借助式（3）校正空氣N2背景的影響。

在此前的研究中，一些學者有考慮到環境本底對29N2濃度測定結果的影響。Dalsgaard等和Nielsen都在各自的研究中提到關于“過剩29N2”的概念，即生物過程產生的29N2［30，34］，但對計算的方法并未給出具體說明。Holtappels等提出了修正29N2背景干擾的具體方法［33］，但并未給出背景29N2/28N2的特征比值，也沒有考慮厭氧氨氧化作用的存在是否會對校正結果產生影響。樣品受空氣污染程度與樣品保存的方式和時間長短有關。多數國外研究并未涉及29N2背景校正這一方面，可能與樣品的存放方式或存放時間有關。即便如此，一個合適的校正方法對獲得準確的反硝化速率仍就十分重要［33］，這也是本研究提出可以準確校正15N示蹤所得反硝化速率的初衷所在。

3.4 29N2校正前后反硝化速率的對比

選取本航次分別位于南海海盆北部和南部的兩個站位 KJ12（18°15.12′N，114°0.12′E）和 KJ63（9°59.94′N，111°0.12′E），以氧極小值層位（分別為1 500 m和800m）經預先趕氣后水體的培養結果進行對比。當測定的數據未經校正處理時，可以明顯地看出平行樣的結果之間存在較大的偏差，且29N2濃度與培養時間之間不存在顯著的線性相關性（p＞0.1）（見圖4）。這可能是由于不同培養瓶在放置過程中受外界空氣擴散影響的程度不同所致，導致29N2濃度隨培養時間增加的信號被背景干擾所掩蓋，由此計算得到的反硝化速率將存在很大的不確定度（RSD＞50%）。相比之下，對空氣29N2背景進行校正后，平行樣之間的偏差明顯減小，且29N2濃度與培養時間的線性相關性水平顯著增加（r2＞0.7，p＜0.001）（圖4），與文獻報道的反硝化作用存在證據相符［23－24，33］。經空氣29N2背景校后得到的反硝化速率不確定度也顯著降低（RSD約為20%）。

就所研究的KJ12和KJ63站氧極小值層位樣品，由式（3）進行空氣29N2背景校正，并由式（1）計算出的反硝化作用潛在速率平均為（1.8±0.2）μmol/（dm3·d）。該數值落在文獻報道的開闊大洋水體反硝化速率范圍［0.000 24～2.7μmol/（dm3·d）］之內［24，28］。

圖4 KJ12站（a）和KJ63站（b）氧極小值層水樣29 N2濃度隨培養時間的變化

4 結論

（1）利用15N示蹤法測量海水反硝化速率的過程中，樣品長時間的存放有可能會受到空氣擴散進入的影響，由此導致29N2濃度的分析結果異常，進而影響反硝化速率的準確定量。

（2）由于空氣中29N2/28N2比值恒定為0.007 35，并且在空氣擴散進入培養體系的過程中該比值幾乎不會發生變化，故提出利用該恒定的比值，通過質量平衡方程校正空氣29N2背景的影響，在培養體系只存在反硝化作用的情況下，將樣品實測的29N2濃度扣除由外界空氣貢獻的29N2濃度，就可得到由生物反硝化作用產生的29N2準確值，進而可獲得準確的反硝化速率。

（3）對南海實際海水樣品的研究表明，經空氣29N2背景校正后，培養體系29N2濃度與培養時間之間的線性關系顯著加強，由此計算出的反硝化速率更為可靠。

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