喜馬拉雅旱獺弓形蟲病血清學(xué)檢測(cè)

喬海生，蔡其剛，馬利青

（青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海西寧810016）

剛地弓形蟲（Toxoplasmagondii）可專性寄生于人和動(dòng)物的除紅細(xì)胞以外的有核細(xì)胞內(nèi)，是一種重要機(jī)會(huì)致病性原蟲，能夠引起人和動(dòng)物弓形蟲病（Toxoplasmosis）［1］。剛地弓形蟲速殖子期特異性P30蛋白，也稱表面抗原1（SAG1），能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgG、IgM 等多種細(xì)胞因子，具有重要的抗原性［2］。Dzierszinski等［3］研究認(rèn)為P30蛋白可能是決定弓形蟲蟲株毒力的重要因素之一。

喜馬拉雅旱獺是青藏高原分布廣泛的一種野生動(dòng)物，可傳播鼠疫等致病微生物，嚴(yán)重威脅著當(dāng)?shù)厝诵蟮陌踩榱私馇嗪Ｊ∠柴R拉雅旱獺體內(nèi)弓形蟲病的感染情況，本研究應(yīng)用弓形蟲的重組蛋白GST－SAG1 作為ELISA 診斷抗原，采用ELISA 檢測(cè)方法，對(duì)青海省祁連縣的92份喜馬拉雅旱獺血清進(jìn)行了弓形蟲病的血清學(xué)檢測(cè)，結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

青海省某地捕獲旱獺92只，現(xiàn)場(chǎng)心臟采血，立即離心（3 000rpm，15min），分離血清，－20℃條件下冷凍保存待檢。谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S－transferase，GST）和GST－SAG1抗原由青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院獸醫(yī)生物技術(shù)研究室制備。標(biāo)準(zhǔn)陰性、陽(yáng)性血清由日本玄學(xué)南博士提供。

1.2 ELISA 方法

1.2.1 重組蛋白的表達(dá)、純化 GST－SAG1融合蛋白采用將編碼T.gondii SAG1 的基因克隆到pGEX－4T－3 質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化到E.coli的方法獲取。再用8 M 的尿素緩沖液透析復(fù)性，然后作為診斷抗原在T.gondii的ELISA 檢測(cè)中應(yīng)用。

1.2.2 抗原的包被 包被液中（50mM Carbonate－Bicarbonate Buffer，pH 9.6）分別按5μg／mL 劑量加入GST 和GST－SAG1抗原，混勻后以每孔50μL加到96孔平底微量板（Castor）的孔中，并且置4℃條件下孵化過(guò)夜。

1.2.3 封 阻 用含有0.05% Tween 20 的1×PBS沖洗液沖洗1 次后，再用含3% 脫脂乳的封阻液（3g脫脂奶粉＋90 mL 蒸餾水＋10 mL 10×PBS）進(jìn)行封阻（每孔100μL），并且置37℃條件下孵化1h。……