S—亞硝基—N—乙酰—DL—青霉胺對巨噬細胞誘導型一氧化氮合酶的影響

胡旭堂　胡海英　王志祿

[摘要] 目的 觀察S-亞硝基-N-乙酰-DL-青霉胺（SNAP）對RAW 264.7誘導型一氧化氮合酶（iNOS）表達的影響，探討NO在動脈粥樣硬化（炎癥）過程中的作用。 方法 以RAW 264.7巨噬細胞為研究對象，分為空白對照組、SNAP組，采用不同濃度（30、100、300、400、500 μmol/L）的SNAP對巨噬細胞進行干預24 h，應用RT-PCR法檢測RAW 264.7巨噬細胞iNOS mRNA的表達，采用Western blotting技術檢測iNOS蛋白的表達。 結果 與空白對照組比較，不同濃度SNAP（30、100、300、400、500 μmol/L）組iNOS mRNA的表達比空白對照組均明顯降低（P﹤0.05），不同濃度SNAP（30、100、300 μmol/L）組iNOS蛋白表達明顯低于空白對照組（P﹤0.05）。 結論 NO可以抑制巨噬細胞自身iNOS mRNA基因轉錄，降低iNOS的合成而發揮負反饋作用。

[關鍵詞] S-亞硝基-N-乙酰-DL-青霉胺：誘導型一氧化氮合酶：RAW 264.7巨噬細胞

[中圖分類號] R543 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）03（b）-0021-04

動脈粥樣硬化是一種發生在血管壁的慢性炎癥過程[1]，在高血脂、高血壓、遺傳、年齡等全身因素和血流動力、毒素、病毒等局部因素作用下，內皮細胞損傷，低密度脂蛋白（LDL）滲出到內皮下聚集并氧化變性，刺激局部內皮細胞表達黏附因子趨化因子配體2（chemokine ligand 2，CCL-2）等促進血液中單核細胞等的黏附和滲出，并分化為巨噬細胞[2]。巨噬細胞在動脈粥樣硬化過程中發揮關鍵作用，一方面其吞噬LDL轉化為泡沫細胞，并壞死形成脂質核；另一方面巨噬細胞是粥樣斑塊中細胞成分的主要部分，可分泌多種細胞因子及NO等改變局部環境，影響斑塊的穩定和疾病的發展[3]。誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）是炎癥的重要標志，其可催化產生大量NO，NO在免疫應答中有著復雜而且呈雙面性的作用，同時NO供體也是應用多年的冠心病治療藥物，NO在免疫應答中的雙面性作用對動脈粥樣硬化病程有什么樣的影響？本研究通過觀察S-亞硝基-N-乙酰-DL-青霉胺（S-nitroso-N-acetyl-DL-penicillamine，SNAP）對RAW 264.7巨噬細胞內iNOS mRNA和蛋白表達的影響，旨在探討NO對巨噬細胞的影響及其在動脈粥樣硬化發展過程中的作用，為臨床治療冠狀動脈粥樣硬化提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RAW 264.7單核巨噬細胞購自中國科學院上海細胞庫，高糖DMEM培養基（美國HyCLone公司）。新生胎牛血清購于杭州四季青生物有限公司。SNAP購自美國Sigma公司。PCR引物合成、RNA提取及逆轉錄試劑盒均由大連寶生物試劑公司提供。兔抗小鼠NOS2多克隆一抗（sc-650）購自Santa公司，辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗購于Raygene 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及實驗分組 RAW 264.7巨噬細胞用含10 %胎牛血清的高糖DMEM培養基，置于37℃、5%CO2培養箱內培養，0.25%胰酶消化、傳代，2～3代后處于對數生長期的RAW 264.7細胞用于實驗。實驗分組：①空白對照組：完全培養基；②不同濃度SNAP組：分別加入30、100、300、400、500 μmol/L的SNAP，作用于巨噬細胞24 h。

1.2.2 RT-PCR檢測iNOS mRNA的表達 收集各組細胞，按照RNA提取試劑盒說明提取總RNA，測定總RNA的量及純度。取2 μl（500 ng）總RNA逆轉錄合成cNDA，再取2 μl逆轉錄產物采用SYBR Ⅱ嵌合熒光法直接進行PCR循環。iNOS的引物序列：上游引物5′-GCTGAACTTGAGCGAGGA，下游引物3′-ACTCAGTGCCAGAAGCTGGA，產物長度185 bp；β-actin的引物序列：上游引物5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC，下游引物3′-ATGGAGCCACCGATCCACC，擴增長度171 bp。兩步擴增法：條件為：一個循環95℃ 10 s；40個循環，95℃ 5 s，60℃ 31 s。結束后進行溶解曲線分析，通過觀察溶解曲線是否為單一峰評價PCR反應產物的特異性，每個反應設置2個復孔。所有RT-PCR實驗至少重復3次。RT-PCR統計分析采用2-ΔΔCt法，ΔΔCt=各組ΔCt（目的基因-管家基因Ct）-對照組ΔCt（目的基因Ct-管家基因Ct）。

1.2.3 Western blotting檢測iNOS蛋白的表達 收集各組細胞，加入裂解液裂解細胞，提取總蛋白。用BCA法進行蛋白定量。用6%SDS-聚丙烯胺凝膠進行電泳分離、每孔的上樣量為100 μg，轉膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后，用一抗iNOS（1∶300）或β-Actin（1∶10000），4℃過夜，PBST洗膜10 min×3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2000），室溫孵育1 h，PBST洗膜15 min×3次。把膜放于WEST PICO 2 min，壓片，顯影，檢測特異性蛋白條帶。用軟件ImageJ進行灰度分析，將各組的iNOS分別于內參β-Actin的光密度值進行比較，兩者的比值代表iNOS蛋白的表達。

1.3 統計學分析

采用SPSS 18.0進行統計學分析，所有數據采用x±s表示，實驗數據組間比較采用單樣本或兩樣本t檢驗，兩樣本t檢驗時檢驗方差齊性，總體方差不齊時采用Cochran﹠Cox法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 巨噬細胞形態

顯微鏡下RAW 264.7巨噬細胞以類圓形或多邊形為主，有1個或兩個偽足伸出（圖1）。

A

B

圖1 顯微鏡下RAW 264.7巨噬細胞

A.10×10倍倒置顯微鏡下未貼壁巨噬細胞照片；B.10×20倍倒置顯微鏡下貼壁巨噬細胞照片

2.2 SNAP對RAW 264.7巨噬細胞iNOS mRNA表達的影響

不同濃度SNAP作用于RAW 264.7巨噬細胞24 h后與空白對照組比較，各干預組iNOS mRNA的表達均明顯下降（P<0.05）（圖2）。

圖2 SNAP對RAW 264.7巨噬細胞iNOS mRNA表達的影響

與對照組比較，*P<0.05

2.3 SNAP對RAW 264.7巨噬細胞內iNOS蛋白含量的影響

與空白對照組比較，不同濃度（30、100、300 μmol/L）SNAP組iNOS蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），且降低和濃度相關（圖3、4）。

圖3 SNAP對RAW 264.7巨噬細胞內iNOS蛋白的影響

1.對照組；2.30 μmol/L SNAP干預組；3.100 μmol/L SNAP干預組；4.300 μmol/L SNAP干預組

圖4 SNAP對RAW 264.7巨噬細胞內iNOS蛋白含量的影響

與對照組比較，*P<0.05

3 討論

巨噬細胞分泌的NO是炎癥過程中的重要物質[4]，本實驗證實其在發揮殺菌及殺死腫瘤細胞的作用的同時，可以抑制巨噬細胞自身iNOS mRNA基因轉錄，降低iNOS的合成而發揮負反饋作用。

NO在體內是一種參與了多種病理生理過程的信號信使分子，包括神經傳遞、炎癥、免疫反應及心血管系統生理病理[4]。NO除了擴張血管作用外對動脈粥樣硬化的影響是多方面的[5]，Martinet等[6]證實NO可以選擇性促進巨噬細胞凋亡而使動脈粥樣斑塊更加穩定。體內的一氧化氮合酶（NOS）可以將L-精氨酸轉化為NO和瓜氨酸，其可分為構成型一氧化氮合酶（constitutive nitric oxide synthase，cNOS）和iNOS。cNOS在機體內持續結構性的表達，包括內皮細胞型一氧化氮合酶（endothelial nitricoxide synthase，eNOS）和神經型一氧化氮合酶（neuronal nitricoxide synthase，nNOS）[7]。iNOS分布廣泛，炎癥因子、LPS、細菌內毒素等刺激后在多種組織、細胞中都可以檢測到，包括巨噬細胞、單核細胞、肺泡上皮細胞等，在炎癥或免疫應答過程中IFN-γ、TNF-α、LPS、內毒素等誘發巨噬細胞高表達iNOS產生大量的NO，NO是脂溶性小分子物質，滲透性強，是炎癥反應局部內重要的活性物質[8]，其在殺滅腫瘤細胞、入侵的微生物等的同時，也能抑制淋巴細胞增殖、TNF-α、IFN-γ炎癥介質的分泌而發揮負向免疫調節功能，并可造成自身組織的損傷[4]。Assreuy等[9]的實驗證實NO可以直接抑制iNOS活性。本實驗進一步證實NO可抑制iNOS基因的轉錄及iNOS蛋白的表達，而不是僅僅抑制iNOS酶活性發揮負反饋作用。

iNOS基因位于17號染色體，由26個外顯子、25個內含子組成，約37 kb大小[10]，上游及下游均有可以和LPS、IRF等作用的啟動子，它們相互作用后啟動基因的轉錄，同時這些區域還包括NF-κB、IRF等信號通路的效應區域，實驗證明NF-κB、IRF等的信號通路和iNOS的轉錄表達等密切相關[11]。NO抑制iNOS轉錄的作用是由于其抑制IFN-γ等炎癥因子分泌引起還是直接作用于基因序列引起？可能兩者都有關，因為有實驗報道NO可以引起核苷酸序列破壞。不管怎樣，其具體機制還需要更多的研究。

動脈粥樣斑塊內存在大量的免疫細胞，以巨噬細胞為主，在正常的動脈血管壁內監測不到NO，但在動脈粥樣斑內存在較高濃度的NO[12-13]。我們的研究證實NO可以抑制巨噬細胞iNOS的表達，這種負反饋機制可能是調節局部炎癥平衡的機制之一。同時巨噬細胞可分為不同亞型，其作用不同甚至相反，主要有促炎型的M1亞型及修復型的M2亞型[3，14]，iNOS也是M1亞型的分化標志[15]，NO抑制巨噬細胞iNOS的表達，可能會促進巨噬細胞向M2亞型分化。有實驗利用人頸動脈斑塊切片，觀察到在粥樣斑塊肩部M1Φ占明顯優勢，只有少數有限的M2Φ存在，在斑塊內部和纖維帽處兩型之間沒有明顯差別[16]。推測粥樣斑塊內巨噬細胞亞型分化的調整，改變了粥樣斑塊的穩定性，最終影響動脈粥樣硬化的病程[3，17]。

已有實驗報道NO除了擴血管作用外，對動脈粥樣硬化病程的作用是多樣的[5-6]，本實驗證實NO能抑制巨噬細胞iNOS的表達而發揮負反饋作用，這種作用可能也會影響動脈粥樣硬化病程，這方面還需要進行更多的研究。

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（收稿日期：2014-02-11 本文編輯：郭靜娟）