miRNA-34甲基化與卵巢癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

邵佳，何愛琴*，張玉泉，劉繼斌

（1．南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦科，江蘇南通226361；2．南通大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，江蘇南通226001；3．南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院研究所，江蘇南通226361）

miRNA-34甲基化與卵巢癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

邵佳1，何愛琴1*，張玉泉2，劉繼斌3

（1．南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦科，江蘇南通226361；2．南通大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，江蘇南通226001；3．南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院研究所，江蘇南通226361）

目的：探討miR-34a和miR-34b／c基因啟動子區(qū)甲基化水平與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系。方法：采用特異性甲基化PCR分別檢測80例卵巢癌患者卵巢癌組織及血漿中的miR-34a和miR-34b／c基因甲基化水平，分析其表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果：80例卵巢癌組織中有58例miRNA-34a甲基化陽性，血漿陽性31例；有69例miRNA-34b／c基因甲基化陽性，血漿陽性40例。聯(lián)合檢測血漿和組織miRNA-34甲基化具有一致性。miRNA-34基因甲基化與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0．05），與患者年齡、腫瘤有無包膜及病理類型無關(guān)（P＞0．05）。術(shù)后76例隨訪3年，有45例復(fù)發(fā)（59．21%），復(fù)發(fā)組癌組織和血漿miRNA-34甲基化陽性率分別為95．6%（43例）、62．2%（28例），明顯高于無復(fù)發(fā)病例組［77．4%（24／31）和35．5%（11／31），P均＜0．05］；發(fā)生轉(zhuǎn)移的36例患者癌組織和血漿miRNA-34甲基化率亦明顯高于無轉(zhuǎn)移組（40例）。結(jié)論：miRNA-34甲基化異常表達(dá)可作為晚期卵巢癌預(yù)后不佳的分子標(biāo)志物。

卵巢癌；miRNA-34；甲基化；PCR

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)的三大惡性腫瘤之一，發(fā)病率占第3位，但是病死率卻位于第1位，預(yù)后較差。因此，尋找一種新的特異性強(qiáng)的分子標(biāo)志物，對提高卵巢癌患者的生存率具有較高的臨床應(yīng)用價值。目前認(rèn)為，相關(guān)的miRNA在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中起到了癌基因和抑癌基因的作用［1］。而miRNA基因甲基化可能是卵巢癌中miRNA異常表達(dá)的調(diào)控機(jī)制［2］。我們采用特異性甲基化PCR分別檢測了卵巢癌組織及血漿中的miRNA-34a（miR-34a）和miR-34b／c基因甲基化狀態(tài)，并分析了其表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系。

1 對象與方法

1．1 病例

80例患者為2009年1月至2010年12月南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦科收治的卵巢癌病例，年齡≤60歲29例，＞60歲51例。其中，54例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，38例腫瘤有包膜。參照FIGO（2009）分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期22例，Ⅲ期27例，Ⅳ期15例。手術(shù)方式：FIGOⅠ～Ⅱ期患者行全子宮＋雙附件＋大網(wǎng)膜＋闌尾＋盆腔、腹主動脈旁淋巴結(jié)清掃。FIGOⅢ～Ⅳ期病例行腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)（均行后腹膜淋巴結(jié)活檢）。術(shù)后除了G1的ⅠA期和ⅠB期7例患者未補(bǔ)充化療外，其余患者均行6～8個療程的紫杉醇＋鉑類化療。術(shù)后均已隨訪和采集外周血、癌組織及癌旁組織；所有患者均簽署知情同意書。

1．2 方法

1．2．1 主要儀器與試劑 Eppendorf系列PCR儀（德國），實(shí)時定量熒光PCR系統(tǒng)（上海索萊寶生物科技有限公司），Bio-Rad凝膠成像分析儀（美國伯樂公司），Eppendorf全自動移液器（上海心亮實(shí)業(yè)有限公司），酶標(biāo)儀（北京市六一儀器廠），DNA測序儀（深圳山奇山生物技術(shù)有限公司），微電腦全自動控制雷射顯微細(xì)胞組織擷取系統(tǒng)、CM3050S冰凍切片機(jī)（德國萊卡儀器有限公司），凝膠成像系統(tǒng)（北京市六一儀器廠），高速低溫落地式離心機(jī)、臺式離心機(jī)（北京時代北利離心機(jī)有限公司），超凈工作臺（廣東上善尚德凈化科技有限公司）。

1．2．2 組織和血漿DNA提取 采用人類組織和細(xì)胞DNA提取試劑盒（德國）提取組織和血漿DNA?；颊呔科鹂崭钩槿⊥庵莒o脈血（抗凝），組織標(biāo)本在離體10min之內(nèi)取材，液氮速凍5min后－80℃保存。

1．2．3 miRNA甲基化定量檢測 應(yīng)用EZDNA甲基化試劑盒（美國Zymo公司）進(jìn)行DNA變性及重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。根據(jù)測序的結(jié)果設(shè)計miRNA特異性引物和探針，應(yīng)用實(shí)時PCR法檢測miRNA甲基化水平。反應(yīng)體系和條件參照試劑盒說明書進(jìn)行，每個樣品都進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，用Human CpGenome Universal Methylated DNA（Chemicon International，美國）作為陽性對照，雙蒸水作為陰性對照。具體步驟：①實(shí)驗(yàn)前先將CT保存試劑混勻，將900 μL水、50μLM-溶解緩沖液以及300μL M-稀釋緩沖液加入到同一試管中。②將130μL的CT保存試劑與上步提取的DNA樣品20μL搖勻混合。③按照以下溫度程序進(jìn)行操作：98℃10 min，64℃ 2．5 h，最后4℃存儲備用。④將660μL的M-鏈接緩沖液加入到Zymo-spin IC吸附柱，再加入樣品，密閉后再顛倒混合數(shù)分鐘。⑤10 000 r／min全速離心1min，去掉離心液。將20μL的M-去璜化緩沖液加入到吸附柱，再放置15～20 min。⑥10 000 r／min全速離心1 min。向吸附柱中加入200μL的M-漂洗緩沖液，多次重復(fù)此步驟。⑦直接加M-洗脫緩沖液10μL到吸附柱的基質(zhì)，放置在1．5 mL試管中10 000 r／min離心2 min，分離出所需的DNA模板。miR-34甲基化引物序列見表1。

1．2．4 特異性甲基化PCR 甲基化PCR反應(yīng)體系為2．5μL10×PCR緩沖液、2．0 mmol／L 4×dNTP混合物0．5μL、3μL引物、0．5μL的TaKaRaTM熱啟動Taq酶、25 mmol／L MgCl22μL以及模板3μL。甲基化擴(kuò)增體系：95℃預(yù)變性12 min，隨后94℃15 s，共40個循環(huán)；55℃30 s，72℃40 s，再72℃延伸10 min。非甲基化擴(kuò)增體系的退火溫度提升至56℃，其他步驟均相同。擴(kuò)增產(chǎn)物為2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光照射顯帶。RT-PCR：取1～2μL甲基化修飾型DNA進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物為2%瓊脂糖凝膠電泳，然后紫外光照射顯帶。

1．2．5 隨訪 統(tǒng)一制訂調(diào)查問卷和隨訪工作手冊，所有資料均由專人編碼，核查正確后雙軌錄入計算機(jī)。對全部病例每3個月隨訪1次，以是否復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或因卵巢癌死亡作為觀察終點(diǎn)。復(fù)發(fā)的評價指標(biāo)是腫瘤病灶再次出現(xiàn)在原有位置，轉(zhuǎn)移的評價指標(biāo)是腫瘤病灶脫離其原發(fā)部位，擴(kuò)散到身體其他部位。

1．3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用EpiData 3．1中文版軟件處理隨訪資料以及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用SAS 9．0軟件進(jìn)行資料分析，組間比較運(yùn)用χ2檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 卵巢癌患者血漿和組織中miR-34甲基化率

80例卵巢癌組織標(biāo)本中檢測出miR-34a基因甲基化陽性58例，而血漿中miR-34a基因甲基化陽性31例。80例卵巢癌組織中miR-34b／c基因甲基化陽性69例，血漿中miR-34b／c基因甲基化陽性40例。

80例卵巢癌組織中，miR-34基因甲基化陽性達(dá)71例，血漿中miR-34基因甲基化陽性41例。2%瓊脂糖凝膠電泳顯示，miR-34a和miR-34b／c基因成單一條帶。

2．2 卵巢癌miR-34甲基化與臨床病理特征的關(guān)系

我們對80例卵巢癌組織和血漿miR-34基因甲基化與患者年齡、腫瘤有無包膜、FIGO分期（2009）和病理類型的關(guān)系進(jìn)行了分析。病理類型中，子宮內(nèi)膜樣癌22例，漿液性癌31例，黏液性癌27例。結(jié)果顯示，miR-34基因甲基化率與FIGO分期相關(guān)（P＜0．05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組無論是卵巢癌組織中還是血漿中的miR-34基因甲基化率均明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。同時發(fā)現(xiàn)miR-34基因甲基化與患者年齡、腫瘤有無包 膜及病理類型無關(guān)（P＞0．05）。見表2。

2．3 miR-34甲基化與卵巢癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

80例患者中有76例（95．0%）術(shù)后隨訪3年，發(fā)現(xiàn)卵巢癌復(fù)發(fā)45例，其中癌組織miR-34甲基化陽性43例（95．6%），血漿miR-34甲基化陽性28例（62．2%）。而未復(fù)發(fā)的31例患者中，癌組織miR-34甲基化陽性24例（77．4%），血漿miR-34甲基化陽性11例（35．5%），復(fù)發(fā)組無論是癌組織還是血漿miR-34甲基化率均明顯高于未復(fù)發(fā)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝4．18和5．25，P均＜0．05）。

36例發(fā)生轉(zhuǎn)移的病例中癌組織miR-34甲基化陽性35例（97．2%），40例未轉(zhuǎn)移的病例中32例（80．0%）甲基化陽性，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝3．86，P＜0．05）。轉(zhuǎn)移組血漿miR-34甲基化陽性24例（66．7%），亦明顯高于未轉(zhuǎn)移組（15例，37．5%），差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝6．45，P＜0．05）。

3 討論

近年來，miRNA作為一類新的癌基因和抑癌基因逐步受到重視。miRNA可能參與了人類所有的生理及病理活動的調(diào)控。miRNA的轉(zhuǎn)錄過程由RNA聚合酶Ⅱ介導(dǎo)，而DNA甲基化是一種重要的使RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的基因表達(dá)沉默的表觀遺傳方式，因此DNA甲基化調(diào)控miRNA的表達(dá)。目前較多研究認(rèn)為，DNA甲基化在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后判斷中發(fā)揮著重要作用。

微陣列芯片技術(shù)的應(yīng)用使得組織中的miRNA表達(dá)譜檢測成為可能，雖然miRNA表達(dá)的變化和不同組織類型腫瘤的生物學(xué)之間的功能性聯(lián)系仍不是十分明朗，但miRNA的保守性及穩(wěn)定性之高使其成為一種新的腫瘤標(biāo)志物，具有較好的臨床應(yīng)用前景。卵巢癌中部分miRNA表達(dá)升高，部分表達(dá)下降，因而miRNA的表達(dá)譜可以鑒別正常卵巢組織與良性、惡性卵巢腫瘤［3］，同時還可以區(qū)分原發(fā)性與繼發(fā)性卵巢癌［4］。在婦科惡性腫瘤中，卵巢癌的致死率無疑是最高的，研究也較為深入。目前認(rèn)為相關(guān)的miRNA在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起到了癌基因和抑癌基因的作用。通常miRNA的DNA甲基化可分為高甲基化以及低甲基化。高甲基化即正常組織中不會發(fā)生甲基化的位點(diǎn)被甲基化，低甲基化則是在正常組織發(fā)生甲基化的位點(diǎn)上出現(xiàn)去甲基化現(xiàn)象。Lujambio等［5］研究發(fā)現(xiàn)，某些腫瘤中miRNA的高甲基化可通過去甲基化劑降低甲基化水平，使miRNA的表達(dá)重新上調(diào)，這表明miRNA的表達(dá)情況明顯受到了啟動子區(qū)CpG島甲基化的影響。Dahiya等［6］檢測15例正常卵巢組織、69例卵巢惡性腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)正常組織與腫瘤組織中89%的miRNA表達(dá)水平不同，其中miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141表達(dá)增高，miR-140、miR-199a、miR-145及miR-125b1表達(dá)明顯下降。Iorio等［7］發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-203以及miR-205在卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)升高，而這三者正定位于DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶作用的CpG島上。且這些miRNA在卵巢癌OVCAR3細(xì)胞株經(jīng)5-Aza-CdR誘導(dǎo)后表達(dá)明顯升高，故推測其表達(dá)上調(diào)是由于DNA甲基化不足引起的，提示miR-21、miR-203以及miR-205的異常表達(dá)受DNA甲基化的調(diào)控，其致癌基因作用參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。Let-7a-3是Let-7家族中的一員，是最早發(fā)現(xiàn)的miRNA之一，定位于CpG島。Kan等［8］發(fā)現(xiàn)Let-7a-3低甲基化引起胰島素樣生長因子Ⅱ表達(dá)異常，從而影響卵巢癌患者預(yù)后，而Let-7a-3高甲基化可明顯降低卵巢癌患者死亡風(fēng)險［9－10］。Corney等［11］研究表明，在上皮性卵巢癌中，miR-34a、miR-34b／c變化最明顯，所有miR-34a的DNA甲基化樣本miR-34a表達(dá)均下調(diào)。57%的miR-34b、miR-34c甲基化樣本出現(xiàn)miR-34b、miR-34c的表達(dá)下調(diào)，用甲基化抑制劑處理后，miR-34a、miR-34b／c重新表達(dá)。2011年Vogt等［12］的研究結(jié)果與其基本相符，表明miR-34a、miR-34b／c的DNA甲基化與卵巢癌具有相關(guān)性。2012年Yang等［13］檢測了26例卵巢癌組織及5例卵巢良性腫瘤組織的DNA甲基化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-130b卵巢癌組織甲基化表達(dá)水平明顯高于良性卵巢腫瘤組織，且miR-130b在卵巢組織中的表達(dá)與其甲基化的水平顯著負(fù)相關(guān)。細(xì)胞水平研究顯示，耐藥細(xì)胞株中的miR-130b甲基化水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于親本株。予去甲基化藥物處理后，miR-130b的甲基化水平明顯下降，其表達(dá)水平顯著上升，從而推斷miR-130b的表達(dá)受甲基化調(diào)控，去甲基化可部分逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞耐藥。上述研究表明miRNA的DNA甲基化具有一定的腫瘤特異性，與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

此外，關(guān)于miRNA的DNA甲基化與其他惡性腫瘤之間的關(guān)系也有較多報道。Roman-Gomez等［14］的研究提示miRNA甲基化是急性淋巴細(xì)胞性白血病預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因素。Hildebrandt等［15］研究發(fā)現(xiàn)，miR-9-1和miR-9-3在腎透明細(xì)胞癌組織中特異性超甲基化，且這兩個基因的高甲基化水平可顯著降低腎細(xì)胞癌患者的無復(fù)發(fā)生存期。

目前臨床上較多采用的是將血清CA125作為卵巢癌病情的評價指標(biāo)，但是CA125有一定的局限性，其特異性不強(qiáng)，在盆腔炎、卵巢巧克力囊腫等良性疾病中也會升高。因此，尋找一種新的特異性強(qiáng)的分子標(biāo)志物很有必要。miRNA甲基化的研究目前還處于初級階段，人們對miRNA調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識仍較淺顯。本研究發(fā)現(xiàn)隨訪的76例卵巢癌患者中，miR-34甲基化與卵巢癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系，血漿中miR-34甲基化狀態(tài)可用來監(jiān)測卵巢癌病情的發(fā)展，并可指導(dǎo)臨床治療。但因本研究樣本量有限，結(jié)論是否符合臨床實(shí)際，仍需大樣本量的臨床驗(yàn)證以及長期的隨訪調(diào)查。

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R737．31

B

1671－7783（2014）06－0513－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140255

*：通訊作者，E-mail：8717717＠qq．com

2014－09－21 ［編輯］ 陳海林