肌肽對缺氧缺血性腦損傷大鼠凋亡生化指標的影響

張香敏， 張展， 程秀永， 徐發林， 賈天明， 欒斌， 賈莉婷

圍產期窒息導致的缺氧缺血性腦損傷(hypoxia-ischemia brain damage，HIBD)是新生兒死亡的主要原因之一。近年來，隨著新生兒復蘇技術的不斷提高，高危新生兒，尤其是早產兒的病死率有明顯下降，但重度窒息患兒可遺留不同程度的神經系統功能障礙，如腦性癱瘓、癲癇、共濟失調及智力低下等。

凋亡是腦損傷的重要機制之一。有研究證實：肌肽通過減輕神經細胞凋亡，從而減輕缺血性腦損傷[1-3]，因此推測是否肌肽也能通過減輕細胞凋亡減輕缺氧缺血性腦損傷。本研究采用7日齡大鼠制作HIBD模型，探討肌肽對缺氧缺血性腦損傷大鼠凋亡生化指標的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 7日齡清潔級SD大鼠(證書編號：SCXK(滬)2008-0016)，雌雄不拘，體質量12～18 g，均購自中科院實驗研究實驗室，并經復旦大學動物倫理委員會批準，按照實驗動物有關保護條例進行，在研究期間新生大鼠與母鼠在同一籠內飼養，光照時間12 h，自由攝食水。

1.2 實驗分組及方法

1.2.1 實驗分組 將42只SD大鼠按隨機數字表法分為3組(每組14只)：(1)肌肽預處理組：在HI誘導前30 min腹腔注射肌肽1次250 mg/kg[4，5]；(2)HI組：在相同條件下用等容積的生理鹽水代替；(3)假手術組：不接受任何治療和處理。

1.2.2 HI模型制作 在室溫(25±2)℃環境下，將大鼠四肢及頭部固定在手術臺上，吸入無水乙醚誘導麻醉；皮膚常規消毒后小心剪開頸部皮膚，逐層分離暴露左側頸總動脈，并小心分離迷走神經，用4個0號外科絲線雙線結扎該動脈并從中間剪斷，造成永久性斷流。此后將大鼠放回到母鼠身邊恢復1.5 h，氧氮混合氣體(8%氧氣/92%氮氣)缺氧箱中持續通入濕化的氮氧混合氣2 h，缺氧結束即制成7日齡大鼠HI腦損傷動物模型。假手術組動物與HI組動物來自同一窩動物，動物置于相同條件下，既不結扎血管阻斷血流，也不置于缺氧箱里缺氧，皮膚切一小口，僅分離左側頸總動脈。建模完成后動物放回母鼠籠內，并送回動物房，由專人飼養。

1.2.3 原位末端標記(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)染色 HI誘導24 h后，將大鼠稱重并給予吸入無水乙醚麻醉，暴露心臟后在右心房用眼科剪刀剪一小口，然后經左心室灌注5 mL生理鹽水，一直到右心房流出清水，再灌入4%多聚甲醛，直到肢體蒼白變硬，迅速剝離腦組織后，然后腦組織在4%多聚甲醛中固定24 h，依次經過梯度酒精和二甲苯脫水后，進行石蠟包埋，腦冠狀切片厚度為3 μm，用于TUNEL染色(n=5)。使用原位細胞死亡探測試劑盒，根據生產廠家提供的方案進行TUNEL染色。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(real time polymerase chainreaction，Real-time PCR) 根據廠家提供的說明書，通過細胞裂解液提取損傷側海馬的總RNA(Invitrogen，USA)(n=5)，在紫外分光光度計260 nm處對RNA進行定量，cDNA通過反轉錄試劑盒合成，嚴格按照廠家提供的實驗步驟進行操作，Real-time PCR通過Real-time PCR儀器(Eppendorf，Germany)逐步進行，基因序列如下：AIF(126 bp)上游引物，5'-GCC AGG GTC CTC ATC GTA TC-3'下游引物，5'-TCC ATT CCA CTG TCT GAA CTG C-3'；Caspase-3(104 bp)上游引物，5'-GCT GGA CTG CGG TAT TGA G-3'下游引物，5'-CGG GTG CGG TAG AGT AAG C-3'；β-actin(104 bp)上游引物，5'-TGT CAC CAA CTG GGA CGA TA-3'下游引物，5'-CAG CAT GTG TTG GCA TAG AGG TC-3'。

1.2.5 計算 根據標準品的不同濃度梯度的Ct值制定標準曲線。各樣本的拷貝數則通過與其內參對照后計算，并取以10為底的對數(log拷貝數)。PCR擴增的特異性通過其熔解曲線來確認。

1.2.6 免疫印跡 采用免疫印跡技術檢測AIF及Caspase-3蛋白表達水平(n=4)，取左側海馬組織，用蛋白提取試劑盒(購于碧云天生物技術研究所)提取組織蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度測定，10%聚丙烯酰胺凝膠帶電泳分離，濕移至醋酸纖維素膜(NC膜)上，10%小牛血清白蛋白室溫搖床上封閉1 h，分別加入稀釋抗體AIF 1∶1 000(美國Millipore公司)；Caspase-3 1∶50(美國Biovision公司)4 ℃冰箱孵育過夜，洗滌后，加入1∶3 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG溶液，室溫搖床上孵育1 h，增強化學發光染色，用圖像處理儀進行光密度分析，得到各條帶的光密度值，以GADPH作為內參照，AIF及Caspase-3與其比值作為相對表達量。

2 結果

2.1 肌肽預處理對大鼠大腦皮質及海馬TUNEL陽性細胞數的影響 見表1。

表1 大鼠腦組織TUNEL陽性細胞數的變化

TUNEL陽性細胞表現HI后凋亡的形態學特征，包括染色質濃縮和凋亡小體。免疫熒光結果顯示：肌肽預處理顯著減少HI 24 h后大腦皮質TUNEL陽性細胞數，與HI組比較差異有統計學意義(P<0.01)；同時，肌肽預處理也顯著降低HI 24 h后海馬CA1區TUNEL陽性細胞數，與HI組比較，差異亦有統計學意義(P<0.01)；大腦皮質和海馬CA1區的TUNEL陽性細胞數在肌肽預處理組和假手術組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 肽預處理對AIF和Caspase-3 mRNA水平的影響 見表2。

表2 大鼠腦組織AIF及Caspase-3基因表達的變化

為了證實肌肽預處理對AIF和Caspase-3 mRNA水平的影響，通過Real-time PCR檢測HI 24 h后AIF和Caspase-3 mRNA水平。Real-time PCR結果表明：未經肌肽預處理的HI組動物的AIF mRNA表達高于肌肽預處理組，差異有統計學意義(P<0.05)，肌肽預處理降低了AIF mRNA的表達，與HI組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。同時，未經肌肽預處理的HI組動物的Caspase-3 mRNA水平也高于肌肽預處理組，差異有統計學意義(P<0.01)，肌肽預處理較為顯著地抑制了HI后Caspase-3 mRNA水平，與HI組比較，差異亦有統計學意義(P<0.01)。但AIF和Caspase-3 mRNA水平在肌肽預處理組和假手術組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.3 肽預預處理對AIF和Caspase-3蛋白水平的影響 見表3。

表3 大鼠腦組織AIF及Caspase-3蛋白表達的變化

在研究肌肽對AIF和Caspase-3基因水平影響的基礎上，為證實肌肽預處理對AIF和Caspase-3蛋白水平的影響，通過免疫印跡檢測了肌肽預處理后AIF和Caspase-3蛋白水平。免疫印跡結果表明：未經肌肽預處理的HI組動物的AIF蛋白水平高于預處理組，差異有統計學意義(P<0.01)；同時，未經肌肽預處理的HI組動物的Caspase-3蛋白也表達高于預處理組，差異有統計學意義(P<0.01)。肌肽預處理不僅顯著地降低了AIF蛋白水平，而且也降低了Caspase-3蛋白水平；AIF和Caspse-3蛋白水平在肌肽預處理組與HI組比較，差異有統計學意義(P<0.01)，但AIF和Caspase-3蛋白水平在肌肽預處理組和假手術組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。蛋白水平與基因水平變化趨勢一致。

3 討論

近年來有關Capase激活與遲發性細胞損傷即凋亡的關系受到廣泛重視。凋亡級聯反應代表許多潛在的治療機會，能夠減輕繼發性腦損傷，使得臨床治療腦損傷切實可行。Caspase介導細胞凋亡的信號轉導，目前公認的各種凋亡刺激因子激活的Caspase家族中的關鍵蛋白酶是Caspase-3，凋亡可通過Caspase依賴和非Caspase依賴途徑誘導，Caspase的活化是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路。AIF是非Caspase依賴細胞死亡途徑的主要組成部分，代表一種重要的神經細胞死亡機制。AIF在非Caspase依賴的細胞死亡調節中起著關鍵的作用，當HI后，由于氧化應激的刺激，引起線粒體內膜的跨膜壓減低，線粒體內膜的通透轉換孔開放，導致線粒體外膜破裂，AIF由線粒體的膜間腔釋放入胞漿，AIF本身是一種脫氧核糖核酸酶，可直接進入核內，促進核染色質濃縮和DNA大片段化[6-8]。與此同時，線粒體膜通透性的改變還可導致細胞色素C和線粒體源Caspase的第二個激活因子釋放入胞漿，通過Caspase途徑啟動凋亡的發生。AIF和Caspase途徑在HI介導的神經病理學方面的作用是平行的，互不影響[9]。因此一旦這兩條途徑被激活就可以通過增加神經細胞的凋亡而導致腦損傷。在HI后數小時腦組織即開始出現神經細胞的凋亡，且隨著HI時間的延長，凋亡的神經細胞逐漸增加，24 h以后達到高峰，然后才逐漸減少，并持續較長的時間，到HI后第7天仍有較多的凋亡細胞。與此同時，機體的氧化代謝產物MDA含量也因HI而持續升高，18～24 h達高峰后逐漸下降，與神經細胞凋亡的時程相符合[10]，而氧自由基清除劑SOD的含量在HI后明顯降低。本研究結果顯示：肌肽預處理不僅抑制HI誘導的AIF和Caspase-3基因表達，而且還抑制AIF和Caspase-3蛋白的表達。

Pekcetin等[1]及許建文等[11]曾報道：肌肽可顯著降低腦損傷動物腦組織TUNEL陽性細胞的表達。本研究結果也表明：肌肽預處理顯著降低了HI大鼠腦組織TUNEL陽性細胞表達，結果與文獻報道一致。由此可推論，肌肽不僅對其他類型的腦損傷具有神經保護作用，而且對HI誘導的腦損傷也具有神經保護作用，而且肌肽的神經保護作用也是通過減少氧化應激從而減少神經細胞的凋亡而實現的。

致謝：非常感謝復旦大學衛生部新生兒疾病重點實驗室提供開放合作課題資金贊助及技術支持。

[1] Pekcetin C，Kiray M，Ergur BU，et al.Carnosine attenuates oxidative stress and apoptosis in transient cerebral ischemia in rats[J].Acta Biol Hung，2009，60(2)：137-148.

[2] Dobrota D，Fedorova T，Stvolinsky S，et al.Carnosine protects the brain of rats and Mongolian gerbils against ischemic injury：after-stroke-effect[J].Neurochem Res，2005，30 (10)：1283-1288.

[3] Stvolinsky S，Kukley M，Dobrota D，et al.Carnosine protects rats under global ischemia[J].Brain Res Bull，2000，53(4)：445-448.

[4] Aydin A F，Kusku-Kiraz Z，Dogru-Abbasoglu S，et al.Effect of carnosine treatment on oxidative stress in serum，apoB-containing lipoproteins fraction and erythrocytes of aged rats[J].Pharmacol Rep，2010，62(4)：733-739.

[5] Aydin AF，Kucukgergin C，Ozdemirler-Erata G，et al.The effect of carnosine treatment on prooxidant-antioxidant balance in liver，heart and brain tissues of male aged rats[J].Biogerontology，2010，11(1)：103-109.

[6] Hangen E，Blomgren K，Bénit P，et al.Life with or without AIF[J].Trends Biochem Sci，2010，35(5)：278-287.

[7] Loeffler M，Daugas E，Susin SA，et al.Dominant cell death induction by extramitochondrially targeted apoptosis-inducing factor[J].FASEB J，2001，15(3)：758-767.

[8] Otera H，Ohsakaya S，Nagaura Z，et al.Export of mitochondrial AIF in response to proapoptotic stimuli depends on processing at the intermembrane space[J].EMBO J，2005，24(7)：1375-1386.

[9] Zhu C，Wang X，Huang Z，et al.Apoptosis-inducing factor is a major contributor to neuronal loss induced by neonatal cerebral hypoxia-ischemia[J].Cell Death Differ，2007，14(4)：775-784.

[10] 劉玲，楊于嘉，劉麗旭，等.高壓氧對新生大鼠缺氧缺血腦損傷模型腦組織神經細胞凋亡及超氧化物歧化酶和脂質過氧化物的影響[J].中國新生兒科雜志，2007，22(2)：89-92.

[11] 許建文，張光軍，邱培勇，等.L-肌肽對高熱驚厥幼鼠神經細胞凋亡的影響[J].實用兒科臨床雜志，2008，23(12)：913-914，967.