脂質體、免疫刺激復合物和殼聚糖作為黏膜免疫載體的研究現狀

王立強 綜述，王洪軍 審校

沈陽軍區聯勤部 疾病預防控制中心，遼寧 沈陽 110034

預防控制病毒性傳染病的關鍵技術是研制免疫原性強和免疫途徑生物利用率高的有效疫苗。目前，已納入國家計劃免疫的疫苗，除少數為口服外，多數以針劑注射為主，而注射疫苗抗原用量大，針頭為潛在的感染源。相比之下，通過鼻黏膜給藥更符合原位免疫設計理念，它可以將病毒控制在感染的起始階段，具有刺激局部黏膜免疫，帶動機體系統免疫的優點。氣溶膠疫苗抗原對黏膜淋巴組織的刺激是產生分泌性IgG的必要條件，可誘導機體產生早期、高效和持久的免疫應答，形成較長時間的抗病毒狀態。因此，鼻黏膜免疫載體和傳遞系統是氣溶膠疫苗鼻腔黏膜免疫策略成功的關鍵。

1 鼻腔給藥特點

鼻腔作為給藥部位具有以下生物學特征：①促進藥物吸收：鼻腔黏膜上有很多細微絨毛，上皮細胞下有豐富的毛細血管和淋巴管，增加了藥物吸收的有效面積，使藥物容易通過鼻黏膜吸收；②避免肝臟的首過效應和胃腸道酶的降解：藥物經鼻黏膜吸收后直接進入體循環，提高了藥物的生物利用度；③給藥方便：以滴入或噴入方式給藥，患者可自行完成。但鼻黏膜絨毛的另一個生理特點是，任何粉末或顆粒在鼻腔的總接觸時間是20～30 min，鼻黏膜上的黏液被纖毛以5～6 mm/min的速度迅速清除[1]。為了解決鼻黏膜免疫的局限性，現已應用近年發展的可降解生物材料脂質體、免疫刺激復合物和殼聚糖等緩釋或控釋微顆粒來延長疫苗在鼻腔內的滯留時間及滯留量，達到提高有效生物利用度的目的。

2 鼻黏膜免疫

傳統的免疫途徑為注射給藥，機體生理順應性差，亦有引起返祖現象。鼻腔黏膜免疫是一種非侵入性疫苗接種途徑。鼻腔中的酶活性相對較低，可以保護疫苗不受酶的降解。據報道，與口服疫苗相比，抗原經鼻黏膜免疫的劑量為口服免疫劑量的1/4，但仍可在血清及黏液中誘導強有力的抗原特異性抗體反應，鼻黏膜免疫不僅可以誘導產生全身性IgG抗體反應，還可以產生黏膜IgA抗體反應，最終形成兩道防御體系來共同保護機體免受傳染性疾病病原的侵害[2]。鼻腔中含有豐富的樹突狀細胞，可以介導強大的全身性及黏膜免疫反應，可以防御各種抗原及病原體通過呼吸系統對機體的侵害。鼻黏膜免疫可在唾液腺及生殖道中產生抗原特異性免疫反應，表明刺激后的淋巴細胞遷移到了共同黏膜免疫系統的特異性效應因子位點，這符合黏膜特異性淋巴細胞歸巢的理論[3]。

3 鼻黏膜免疫載體

脂質體（liposome）、免疫刺激復合物（immune stimulating complexes，ISCOM）和殼聚糖（chitosan，CS）是近年發展的黏膜免疫載體。

3.1 脂質體

脂質體是由同心脂質雙分子層包圍一個水核形成的球形小囊，可以攜帶脂溶性和水溶性的抗原，主要由磷脂和膽固醇組成[4]。脂質體作為一種新型疫苗載體，具有許多生物學特點：①增強抗原透入細胞的能力，能將目的抗原特異傳遞到靶細胞中，無毒無免疫原性，減少了疫苗對鼻黏膜的毒性和刺激性[5]；②穩定抗原，防止疫苗抗原被黏膜上的酶類降解而失活，使黏膜免疫部位保持高的疫苗濃度[6]；③包被脂質體的抗原可長期在吞噬細胞和抗原提呈細胞中存在，持續釋放被包封疫苗，形成長效緩釋作用[7]；④脂質體作為鼻黏膜免疫佐劑具有生物黏附特性，膜表面帶負電荷比帶正電荷的脂質體有更強的誘導抗體形成的能力，膜表面帶有抗原的脂質體載體的作用比膜內帶有抗原的脂質體載體更強；特別是帶正電荷的脂質體生物黏附性較強，能減少疫苗被黏膜纖毛的清除，使疫苗較長時間保持有效血藥濃度，提高生物利用度[8]；⑤可作為鼻黏膜免疫載體，刺激機體的黏膜和全身免疫應答反應；⑥具有生物低密度，可生物降解，易于制備，使用方便。脂質體發揮佐劑作用不受其與抗原連接形式的影響，只須將兩者簡單混合即可[9-10]。

多種病毒抗原包入脂質體內可以用于鼻腔黏膜接種。此外，將變應原包入脂質體內鼻腔給藥，還可抑制特異性IgE抗體反應，從而阻止吸入或食入抗原時引起的變態反應。Childers等[11]首次以人體為對象，研究了鼻內接種脂質體-蛋白菌苗后引起的免疫反應。所用抗原系富含葡萄糖基轉移酶的變異鏈球菌粗制抗原制劑（C-GTF）。受試者鼻內接種包被C-GTF的脂質體后，鼻洗液中特異性抗C-GTF IgA水平有所提高，誘生的唾液特異性IgM和IgA2水平提高程度較低，血清中IgM和IgA水平也有增加。通過進一步比較鼻內接種包被C-GTF的脂質體后誘生的免疫應答與單純C-GTF誘生的免疫應答，發現脂質體-抗原組中只有鼻洗液特異性IgA1應答顯著強于單純抗原組，提示脂質體可影響局部黏膜免疫應答的強度，而不影響全身應答反應。

脂質體作為氣霧疫苗載體，其安全性日益受到關注。小鼠和人體實驗結果均表明，脂質體鼻腔給藥是安全的。賴氨匹林脂質體家兔鼻腔給藥[12]，20 d后處死，顯微鏡下觀察，發現鼻黏膜血管無病理改變，纖毛完好，組織無出血或炎細胞浸潤；而給予水溶液的對照組，鼻黏膜血管有輕度損害，纖毛卷曲，有少許炎細胞浸潤。脂質體作為載體存在的問題是：①脂質體的尾部脂肪酸易被氧化，影響其穩定性；②小脂質體囊相互融合成大脂質體，易破壞脂質體膜；③批間差異較大。

3.2 免疫刺激復合物

ISCOM是一類以脂質（lipid）、皂素（saponin）為主的復合型佐劑。在ISCOM基質中，皂素分子Quil A結合于固醇類和磷脂酰膽堿，可形成穩定的網狀結構，其直徑為30～40 nm，能夠與抗原疏水部分結合，從而將其親水面暴露于免疫細胞[13]。

ISCOM是Morein于1984年發現的一種新的疫苗輸送系統[14]。其作用機制是，捕獲大量抗原分子并釋放給抗原提呈細胞，刺激B細胞反應，增加抗體產生，誘導T細胞反應，刺激產生CD4+、CD8+T淋巴細胞和細胞因子IL-12，促進MHC分子的表達，促進CTL活性和細胞免疫[15]。ISCOM也可以促進病毒蛋白的攝取、加工和呈遞給特異性CD8+T淋巴細胞，但在鼻腔內上皮細胞不能攝取ISCOM-Matrix投遞的抗原，暗示鼻內免疫時，上皮細胞不能被特異性細胞毒性T細胞識別并殺死[16]。其優點是能夠快速、有效地將抗原提呈給免疫系統，可在免疫后迅速激活機體的細胞免疫應答和體液免疫應答效果。其復合疫苗與傳統疫苗相比，疫苗抗原的需求量減少至1/10～1/2[17]，能夠增加抗體反應水平和持久性，也能產生強的細胞介導的免疫反應。而且，復合形成的蛋白抗原性與游離形式的溶液相比穩定性增強。IS?COM疫苗的穩定性極好，能被冷凍、凍干，并能溶解于多種緩沖液中，有利于疫苗的保存、貯藏。

ISCOM作為疫苗載體能夠發揮免疫佐劑作用：①能夠引發MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類CTL反應，平衡Th1和Th2反應，產生包括所有同型和亞型的抗體反應，增強長期的記憶反應[18]，具有免疫調節作用；②誘導IL-2、IFN-γ、IL-12等多種細胞因子，細胞因子之間具有相互激發誘導連鎖反應作用[19]；③可以黏附用藥，滿足黏膜輸送系統的要求；鼻腔接種或口服后能引起多種反應，包括遠端的腸道、生殖道的黏膜反應；④能更有效地遞呈抗原，適于各年齡段人員免疫；⑤ISCOM包含的抗原可以是一種病毒的包膜蛋白、細胞膜蛋白或含疏水區的任何抗原；非疏水性抗原可以加入疏水的尾部，或通過酸處理暴露隱藏的疏水區再整合到ISCOM中[20]，因此能在相對長的時間內起作用。

自1984年Morein等公布ISCOM技術后，這一新的佐劑系統已在多種疫苗中得到應用。馬流感病毒和ISCOM整合疫苗已于1989年在瑞典上市，并沒有嚴重副反應。人用疫苗目前僅Flu-ISCOM進入臨床試驗，其Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗已完成，期待這種新的技術能給傳統的疫苗帶來變革。將含有ISCOM的疫苗注射接種后，T細胞應答首先在引流淋巴結中被檢測到，接種50 d后，在骨髓中也有大量抗體產生細胞[21]，由于抗原提呈細胞的內體小泡和泡質溶膠的雙重作用，含ISCOM的疫苗可以通過MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ兩種途徑將抗原提呈給免疫系統，同時激活CD4+和CD8+T淋巴細胞[22]。含ISCOM的疫苗的另一個優點是可以經口服或鼻腔接種獲得免疫，且能達到在局部和全身黏膜表面誘導有效和特異的黏膜免疫應答。小鼠鼻腔接種流感ISCOM疫苗后，可誘導堅強的黏膜抗體和CTL應答反應，并可抵抗攻擊感染。氣霧ISCOM疫苗除了可以引發MHC-Ⅰ介導的CTL活性外，還有全身性免疫應答，包括特異抗體、分泌型IgA、CD8+T細胞應答等[23]。重復低劑量氣霧免疫ISCOM疫苗不會引起免疫耐受[24]。

ISCOM在使用上也存在一些限制性因素。它并非可以和任何抗原都能形成復合體[25]，只有那些含疏水基團很多的抗原或免疫原才能與ISCOM形成復合體，含親水基團多的抗原（免疫原）不適合與IS?COM佐劑混合制備疫苗。

3.3 殼聚糖

殼聚糖是帶陽電荷的線性多糖，是一種生物粘性物質，由殼質所產生，存在于甲殼類的殼中，通過脫乙酰作用而形成，可有一系列的脫乙酰程度和不同的相對分子質量。殼聚糖谷氨酸鹽的平均相對分子質量約為250×103，脫乙酰程度為80%以上，水溶性（pH6.5），在單一的殼聚糖溶液組方時，其生物利用度可增加5～6倍[26]。殼聚糖又是一種天然聚多糖，有良好的生物相容性和生物可降解性，其分子中的葡糖胺基荷正電，與荷負電的DNA可產生靜電作用，凝聚為多聚復合物[27]，這種納米粒子可以克服疫苗經黏膜吸收的生理學屏障，通過細胞內吞途徑，抵達黏膜下淋巴組織，能夠與鼻上皮細胞及其黏液層起強烈作用，以保證在被黏膜纖毛清除之前使疫苗通過鼻黏膜[28]。殼聚糖還可以通過上皮細胞之間緊密連接處的暫時開放而增加極性疫苗細胞旁路搬運的能力。實驗證明，殼聚糖遞送系統可明顯增強流感疫苗在小白鼠體內的免疫反應。殼聚糖納米粒比溶液制劑更有效地促進黏膜對疫苗的吸收，增強機體對疫苗的免疫反應[29]。

殼聚糖是自然界中惟一含游離氨基堿性基團的可食性動物纖維，殼聚糖作為黏膜疫苗載體，具有良好的生物相溶性、低毒性及促滲作用[30]，在鼻黏膜免疫領域倍受關注，它能與活體組織相容，被體內的溶菌酶、胃蛋白酶降解后，降解產物能完全被人體吸收，無毒、無副作用。殼聚糖還具有良好的凝結能力和免疫刺激活性。研究證明，與普通的水溶性流感疫苗相比，含有可溶性殼聚糖的流感疫苗能促進小鼠體內血凝抑制抗體的產生[31]。基于上述生物特性，殼聚糖在黏膜免疫中得到了廣泛應用。殼聚糖作為黏膜疫苗載體的作用機制表現如下：①黏膜吸附特性：殼聚糖分子中的羥基、氨基可與黏膜粘液中帶負電荷的糖蛋白形成氫鍵而產生黏附作用，延緩抗原的清除，使其有更多的時間與黏膜接觸，使抗原易穿過黏膜屏障，與黏膜下的淋巴組織發生作用；殼聚糖的黏膜吸附性能誘導黏膜和系統免疫反應，與小腸中下游黏膜之間的黏附性，能夠加強它與腸腔表面的緊密接觸，有利于微球繼續向集合淋巴結轉運，進而引起全身及黏膜免疫反應[32]；②促滲作用：殼聚糖可使黏膜上皮細胞緊密結合蛋白的結構發生改變，從而開放跨膜通道，提高黏膜通透性，促蛋白抗原大分子的跨黏膜吸收；用殼聚糖及其衍生物作用于細胞單層，可引起跨上皮細胞電阻降低，促進疫苗抗原順利通過細胞旁路進入體內，增強疫苗的滲透吸收，提高抗原的生物利用度[33]；③殼聚糖在黏膜免疫中的佐劑效應：疫苗經鼻黏膜免疫產生的免疫反應常不能達到理想的免疫效果，故須依賴一些有效的黏膜免疫佐劑和載體系統，而殼聚糖能夠提高巨噬細胞、T細胞、漿細胞、B細胞、嗜酸性粒細胞及多形核細胞的活性和積聚能力，阻止病原微生物的侵入和定居，誘導細胞因子如IFN-γ、IL-4等的產生，激發有效的T細胞免疫應答，中和細菌毒素，增強遲發型變態反應和細胞毒性T細胞反應。殼聚糖自身還可引起IL-10釋放及黏膜IL-4的表達，并激活脾臟的CD4+T細胞，明顯上調黏膜Th2免疫反應，巨噬細胞攝取殼聚糖后即可活化[34]。殼聚糖的這種非特異免疫佐劑作用與其脫乙酰化程度和劑型有關，脫乙酰化程度高的可溶性殼聚糖活性較弱，而顆粒狀殼聚糖更易誘導巨噬細胞的吞噬作用[35]。殼聚糖可有效促進局部（特別是黏膜局部）的免疫反應，增強抗原傳遞系統功能，具有免疫佐劑和免疫調節效應。

4 結語

綜上所述，脂質體、免疫刺激復合物和殼聚糖作為新型鼻黏膜免疫載體或佐劑，為鼻腔黏膜途徑給藥開拓了更為廣闊的應用前景。目前脂質體尚存在不夠穩定等缺點，給長期貯存及用藥帶來不便。應結合鼻腔黏膜的生理結構特點來綜合考慮脂質體的粒徑大小、表面電荷和制備方法等因素，以達到最佳應用效果。免疫刺激復合物佐劑是適合所有疫苗的通用免疫調解技術平臺，它能夠刺激機體對常規疫苗用量1/10的抗原產生相同或更強的抗體和細胞免疫反應，而且這種反應持續時間長，未見過敏反應或其他嚴重毒害事件發生的報道。以ISCOM為載體的抗宮頸癌疫苗和高效低毒流感疫苗已進行Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗，市場潛力巨大。殼聚糖是天然來源的多糖類陽離子高分子材料，來源廣泛，納米微粒、微球制備工藝簡單，不需有機溶劑，有利于疫苗的穩定。目前水溶性殼聚糖品種不多，一般需要溶解于醋酸等弱酸溶液中，由于pH值較低，DNA疫苗容易在制備過程中降解，因而開發和采用水溶性好的殼聚糖衍生物是十分必要的。隨著研究的深入和新劑型的開發，殼聚糖納米載體和PEG交聯殼聚糖季銨鹽水凝膠作為佐劑和載體，將會在黏膜免疫產業化進程中發揮重要作用[25]。因此，新型鼻黏膜疫苗的開發，主要通過鼻黏膜表面抗原呈遞系統的改進來實現。國外科學家已將痘病毒氣霧疫苗成功地應用于猴體試驗，安全有效，艾滋病和人乳頭狀瘤病毒氣霧疫苗、麻疹氣霧疫苗已經世界衛生組織批準進入了臨床試驗。

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