以整合素αvβ3為靶點的腫瘤靶向制劑

楊旺桂，劉芳，邊疆

重慶佳辰生物工程有限公司 生物研究中心，重慶 400084

腫瘤的發病率呈上升趨勢，治療方法也在不斷發展，尋找腫瘤的生物標志物進行靶向治療已成為主流方向。血管是腫瘤獲取營養的來源，抑制腫瘤血管生成可抑制腫瘤的生長和轉移。因此，腫瘤血管的生物標志物也是腫瘤治療不可抗拒的選擇。2004年2月，以血管內皮生長因子（VEGF）為靶標的抑制血管生成的抗腫瘤藥貝伐單抗被美國食品藥品監督管理局（FDA）批準上市，成為重磅炸彈產品，這也為其他以腫瘤血管生物標志物為靶標的藥物打開了成功的大門。

整合素是一類異二聚體跨膜細胞表面受體，由一個α亞基和一個β亞基通過非共價鍵結合而成，是細胞與細胞、細胞與細胞外基質（ECM）之間相互作用的媒介。迄今已報道的整合素有24個，包括18個α亞基和8 個β亞基[1]。整合素與ECM 蛋白結合，促進細胞的活動和侵襲[2]，在血管生成和腫瘤轉移中發揮重要作用[3]。在特定環境中，整合素能否與ECM的配體結合，決定著細胞的存活或凋亡[2]。整合素與其配體結合后，啟動細胞內的信號傳導途徑，誘導細胞遷移、存活、侵襲等活動[3-4]；整合素與配體的結合受阻，則會引起細胞凋亡[5]。

整合素αvβ3 是目前研究最廣泛的整合素家族成員，在休眠的內皮細胞和其他正常組織中低表達甚至不表達[6]，但在多種腫瘤細胞[2]及腫瘤新生血管內皮細胞中[7-9]的表達量卻會急劇升高，因此成為理想的抑制腫瘤及腫瘤血管生成的靶點。臨床研究表明，整合素αvβ3 的表達水平與腫瘤分級呈正相關，是腫瘤惡性程度的標志[8,10]。通過抑制αvβ3的功能，可誘導新生血管內皮細胞凋亡，從而使腫瘤無法獲得生長必需的營養，促使腫瘤細胞凋亡，達到抗腫瘤的目的，而這個過程并不會對正常組織的血管造成不良影響[7-8]。

整合素αvβ3 通過識別RGD（Arg-Gly-Asp）序列，與其細胞外配體結合實現細胞信號傳導。RGD序列普遍存在于ECM 的玻璃粘連蛋白、纖維結合蛋白、骨橋蛋白、人纖維蛋白原等黏附蛋白中，在整合素識別其配體過程中起重要作用[11]。由于腫瘤細胞和腫瘤血管內皮細胞都能高表達整合素αvβ3，因此RGD 序列不僅能結合到腫瘤新生血管內皮細胞，還能與腫瘤細胞結合[12]。正因為這一優勢，使RGD 得到眾多研究者的關注，并設計和制備RGD 肽及其衍生物制劑進行腫瘤的診斷和治療。

1 RGD診斷試劑

用放射性核素標記RGD 肽及其衍生物制備示蹤劑，進行整合素αvβ3 表達水平的顯影，達到腫瘤診斷的目的，已得到廣泛關注和研究。Chen 等[13-14]發 現，［18F］FAl-NOTA-PRGD2、［68Ga］Ga-NOTAPRGD2和［18F］FPPRGD2 都有良好的整合素αvβ3 靶向性，且在顯影和藥代動力學方面沒有顯著差別，但［18F］FAl-NOTA-PRGD2和［68Ga］Ga-NOTA-PRGD2比［18F］FPPRGD2 的制備更加簡單，表現出更好的應用前景。多中心臨床研究表明，作為整合素受體顯影的臨床示蹤劑，99mTc-3PRGD2 可敏感地用于肺癌的診斷[15]。［18F］AH-111585具有良好的生物分布，可無創檢測腫瘤血管，在Lewis肺癌的小鼠模型中能如實反映抗腫瘤治療的效果[16]，在7名患者中成功地檢測出了原發和轉移的乳腺癌[17]。另外，有多個放射性核素標記的RGD 肽及其衍生物正進行臨床試驗，GE Healthcare 開發的［18F］AH-111585 已在2012 年9月完成Ⅱ期臨床試驗。

2 RGD-脂質體抗腫瘤制劑

脂質體作為藥物載體具有以下優點：既可包載疏水性藥物，也能包載親水性藥物；具有良好的藥代動力學，可保護包載的藥物不被降解；表面用靶向抗體或配體修飾后具有特異靶向性[18]。RGD-脂質體可靶向高表達整合素αvβ3 的腫瘤細胞和腫瘤血管內皮細胞，在腫瘤治療中作為抗腫瘤藥物的載體，可提高療效并降低副作用，具有廣闊的應用前景[19]。

目前，以RGD-脂質體進行的抗腫瘤研究，主要將其作為放射性核素、細胞毒藥物、siRNA 等的載體，把藥物匯集在腫瘤組織，并通過內吞作用，使藥物進入腫瘤血管內皮細胞和腫瘤細胞，提高它們的抗腫瘤作用。人臍靜脈內皮細胞結合和內吞RGD-10B 脂質體的活性比RAD-10B 脂質體和PEG-10B 脂質體都高，且細胞活力下降程度較后兩者更顯著[18]。在人肺癌細胞A549和人臍靜脈內皮細胞的藥物吸收研究中，RGD-紫杉醇脂質體和紫杉醇脂質體的細胞吸收比泰素（Taxol）高3倍以上，RGD-紫杉醇脂質體比紫杉醇脂質體高約40%[20]。在人肺癌A549 裸鼠模型中，RGD-紫杉醇脂質體處理組的腫瘤微血管密度顯著低于紫杉醇脂質體處理組[20]。RGD-阿霉素脂質體通過受體介導的內吞作用，可有效地把阿霉素載入腫瘤細胞，從而使腫瘤細胞中具有較高的阿霉素濃度[21-22]，對黑色素瘤細胞B16和A375的IC50分別僅為阿霉素脂質體的52%和68%[21]。B16 小鼠模型中，RGD-阿霉素脂質體比阿霉素脂質體更有效地抑制了腫瘤生長，兩者延長小鼠的存活時間分別是生理鹽水處理組小鼠壽命的25.2%和12.0%[21]。同樣，在C26 直腸癌小鼠模型中，RGD-阿霉素脂質體的療效比阿霉素和阿霉素脂質體更好，RGD-阿霉素脂質體延長小鼠的存活時間為18 d，阿霉素脂質體為15 d[23]。因此，以RGD-脂質體作為藥物載體進行抗腫瘤治療，使腫瘤細胞和腫瘤血管內皮細胞對抗腫瘤藥物的吸收增多，提高了抗腫瘤藥物的療效。

在RGD-脂質體表面修飾細胞穿膜肽，可提高脂質體的細胞吸收率；而修飾另一個靶向配體制備成雙靶向脂質體，則可提高靶向特異性。八聚精氨酸（R8）作為細胞穿膜肽修飾于RGD-PEG-siRNA 脂質體表面后，人臍靜脈內皮細胞的吸收率和轉染效率較RGD-PEG-siRNA 脂質體和PEG-siRNA 脂質體均高得多，而這3 種脂質體在不表達整合素αvβ3的皮膚內皮細胞中，其細胞吸收和基因表達卻沒有顯著差異[24]。RGD/anginex（腫瘤血管生成抑制肽）雙靶向脂質體在體外表現出協同靶向效應；在B16F10 黑色素瘤小鼠模型中，雙靶向脂質體的特異性較anginex-脂質體和RGD-脂質體高[25]。

另外，腫瘤細胞可通過表達P-糖蛋白而擁有耐藥性[26-27]，給腫瘤治療帶來不利，采用交叉給藥可提高療效。在阿霉素抗性的人乳腺癌MCF7/A 小鼠模型中，用RGD-P-糖蛋白siRNA 脂質體與RGD-阿霉素脂質體交替給藥，腫瘤生長被顯著抑制[19]。

3 RGD-膠束抗腫瘤制劑

聚合物膠束具備獨特的核-殼結構，其疏水核提供天然的疏水性藥物載體環境，親水殼維持膠束在水溶液中的穩定性，是難溶性藥物理想的給藥備選方案。

聚合物膠束作為藥物載體具有容易制備、粒徑小（10～100 nm）、穩定性好、載量大、釋放可控的優勢[28]。制備膠束的聚合物有聚乙二醇-聚乳酸[28-31]、聚乙二醇-聚賴氨酸[32]、聚乙二醇-聚己內酯[33]、聚乙二醇-硬脂酸-殼聚糖[34]等兩親性化合物。聚合物膠束本身沒有主動靶向功能，但可在循環系統中長時間保持穩定，通過EPR 效應，即被動靶向作用，作為抗腫瘤藥物的給藥系統[35]。在大多數臨床條件下，被動靶向給藥副作用較大，因此，通過特異性配體、抗體進行主動靶向給藥，是膠束給藥系統的發展趨勢。

把兩親性聚合物的親水端與RGD 肽或其衍生物偶聯，制備的RGD-聚合物膠束可靶向腫瘤細胞的整合素αvβ3和αvβ5[36-37]。實驗發現，黑色素瘤細胞B16和人臍靜脈內皮細胞對RGD-聚合物膠束的吸收率分別比非靶向聚合物膠束高3.3和2.7 倍[28]，RGD-阿霉素聚合物膠束對MDA-435/LCC6WT細胞和MDA-435/LCC6MDR細胞的毒性分別是非靶向阿霉素聚合物膠束的10 倍和78 倍[33]；在MDA-435/LCC6WT小鼠模型中，注射RGD-阿霉素聚合物膠束的處理組，其存活時間顯著高于非靶向阿霉素聚合物膠束組、阿霉素組和生理鹽水組[33]。同樣劑量的阿霉素，RGD-阿霉素聚合物膠束比阿霉素注射液更有效地抑制腫瘤生長，且沒有明顯的副作用[33]。RGD-阿霉素聚合物膠束在血漿中能維持較高的阿霉素濃度，在心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟中的阿霉素則顯著低于阿霉素注射液；在腫瘤組織中，RGD-阿霉素聚合物膠束的阿霉素濃度顯著高于非靶向阿霉素聚合物膠束[29]。腫瘤切片免疫染色發現RGD-阿霉素-考布他汀A4 聚合物膠束對CD31 陽性的小鼠腫瘤血管抑制率為84.6%，顯著抑制了腫瘤細胞的繁殖，具有優越的抗腫瘤療效[29]。B16F10 黑色素瘤小鼠模型注射RGD-阿霉素-考布他汀A4 聚合物膠束的腫瘤抑制率為90.3%，注射非靶向阿霉素-考布他汀A4 聚合物膠束的腫瘤抑制率則為66.7%，前者顯著優于后者；延長小鼠存活時間上，靶向膠束也較非靶向膠束長，分別為生理鹽水處理組小鼠壽命的82.2%和36.8%[29]。RGD-紫杉醇聚合物膠束對惡性膠質瘤U87MG 細胞的抑制能力較紫杉醇高2.5 倍，與非靶向紫杉醇聚合物膠束、紫杉醇處理組相比，顯著延長了荷瘤裸鼠的生存時間[30]。

此外，RGD-聚合物膠束包載超順磁納米粒，可作為核成像探針對腫瘤進行靈敏地檢測，是腫瘤診斷和腫瘤治療監控的有力工具[31,38]。

4 RGD-納米粒抗腫瘤制劑

納米粒作為藥物載體的主要作用是將藥物輸送到特定的細胞群，并釋放藥物發揮療效，而在其他部位則盡量減少藥物的滯留，使系統的毒性最小化。納米粒包括聚合物納米粒[39-44]、脂質納米粒[45-46]、順磁納米粒[47-48]、生物大分子納米粒[49]等，通過適當的方式在其表面修飾RGD 肽或其衍生物，可實現納米粒的腫瘤靶向作用。

RGD-納米粒與高表達整合素αvβ3 的血管內皮細胞和腫瘤細胞有很強的親和性，載藥后提高了藥物對靶細胞的毒性。以聚氧乙烯-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷包裹疏水性納米晶制備的納米粒，在100%胎牛血清中保持穩定，與生物大分子發生的非特異性結合僅限于較低水平，表面修飾cRGD（cyclo RGD）后，對高表達整合素αvβ3 的U87MG 膠質瘤細胞有很強的親和性，而對低表達整合素αvβ3的MCF-7 乳腺癌細胞僅發生微量的結合[43]。以c（RGDfK）和轉鐵蛋白修飾的多分枝兩親性共聚物——聚胺酯丙交酯/L-磷脂酰乙醇胺共聚物嵌段制備的雙靶向紫杉醇納米粒，對人臍靜脈內皮細胞的毒性比紫杉醇提高了10 倍，對高表達轉鐵蛋白受體的人宮頸癌細胞的毒性提高了2 倍[42]。說明靶向載藥納米粒通過受體介導的內吞作用使藥物有效進入血管內皮細胞和靶向腫瘤細胞。

RGD-納米粒的腫瘤組織靶向性，提高了藥物的抗腫瘤療效，延長了荷瘤小鼠的生存時間。c（RGDfK）-脂質納米粒在體外能被高表達整合素αvβ3 的HEK293（β3）細胞特異性結合并內吞，靜脈注射HEK293（β3）移植瘤裸鼠模型后，cRGD-脂質納米粒可累積在腫瘤部位[46]。c（RGDyK）-PEG-聚環丙烷碳酸酯紫杉醇納米粒比PEG-聚環丙烷碳酸酯紫杉醇納米粒、泰素顯示出更強的穿透性，并積聚在腫瘤組織，顯示較強的腫瘤生長抑制作用[40]。c（RGDyK）-聚環丙烷碳酸酯納米粒載藥系統可以能量依賴的方式將紫杉醇轉運到人U87MG 惡性膠質瘤細胞中，使細胞微管明顯變得更加穩定，抑制了腫瘤細胞的繁殖，延長U87MG 小鼠模型的存活時間為生理鹽水處理組小鼠壽命的52.4%，高于非靶向紫杉醇聚環丙烷碳酸酯納米粒的28.6%[41]。生長在大腦的惡性膠質瘤進行藥物治療時，藥物須通過血腦屏障和血管-腫瘤屏障，導致腫瘤對藥物的吸收非常有限，嚴重影響了療效[50-52]；當把腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）基因組裝到RGD-納米粒（RGD-PEG-PEI/pORF-hTRAIL）中，與靶向腦部血管的紫杉醇膠束（CDX-PEG-PLA-PTX）聯合給藥時，可顯著延長顱內惡性膠質瘤（U87）裸鼠模型的生存時間[44]。另外，RGD-納米粒在腫瘤部位的濃度高于肝臟、脾和肺，RGD-白介素2 基因納米粒處理的神經母細胞瘤（Neuro-2A）小鼠模型，其腫瘤體積比對照小了75%，且該處理組有三分之一的小鼠長期生存[45]。

RGD-納米粒除了可作為藥物載體進行抗腫瘤治療外，也可作為探針進行腫瘤診斷和治療過程的監控。人臍靜脈內皮細胞和卵巢癌細胞（MLS）對RGD-超小順磁氧化鐵納米粒（RGD-USPIO）的吸收顯著高于非靶向納米粒，在惡性膠質瘤（U87MG）裸鼠模型中，RGD-USPIO 主要集中在腫瘤新生血管區域[48]。通過活體顯微鏡檢查、核磁共振成像、整體熒光顯像等技術的多模態成像，RGD-順磁量子點納米粒可監控腫瘤血管的生成[47]。以靶向核素、整合素αvβ3、Tnc蛋白的AS1411、RGD、TTA1制備的多適配體靶向納米粒作為腫瘤探針進行腫瘤診斷，顯示出比AS1411、RGD、TTA1 單個探針更強的特異性和信號強度[41]。

5 結語

發現RGD是細胞識別位點至今已超過20年，對其在疾病診斷和治療中的應用備受關注。對RGD腫瘤診斷試劑的研究已進入臨床階段，而以RGD 制備靶向抗腫瘤藥物還未見相關的臨床試驗報道。RGD-納米抗腫瘤制劑，包括脂質體、膠束和納米粒，在體外和動物移植瘤模型中都表現出比非靶向納米抗腫瘤制劑和已上市藥物有更好的療效，其在臨床上的應用效果值得期待。

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