外體和病毒感染

張曉陽，董春艷，段銘

吉林大學人獸共患病研究所/人獸共患病研究教育部重點實驗室，動物醫學學院，吉林 長春 130062

外體（exosome）是一種直徑為30～100 nm 的源自細胞內體（endosome）的小囊泡，是細胞分配和區劃管理其內生物大分子的途徑之一。1987 年，Johnstone 及其同事在網織紅細胞變成成熟紅細胞的研究中首次發現了這一特化的“細胞器”[1]。現有研究結果證實，許多哺乳動物的細胞都能分泌外體，例如腸上皮細胞、肥大細胞、成纖維細胞、血小板、抗原遞呈細胞、肝細胞、淋巴細胞及腫瘤細胞。被釋放的外體可與受納細胞表面的受體結合，通過與細胞膜融合，將其內含有的生物大分子釋放入受納細胞，從而影響和調控系列的生物學進程，如血管生成、細胞增殖、基因表達和免疫應答等。細胞可通過動態地改變外體的分泌、釋放和內容物的組成來應答多樣化的生物學事件（包括微生物的感染）[2-4]。

病毒是嚴格寄生于宿主細胞的一種傳染性因子。病毒感染致病涉及病毒與機體兩個復雜生物系統及其二者間的相互作用。一方面，宿主表現出對病毒感染的主動限制；另一方面，病毒會主動地使宿主細胞為其感染和復制提供必需的細胞機器。外體作為一種特化的“細胞器”，必不可少地出現在了病毒和宿主細胞相互作用的過程中。在此，我們以介紹外體的組成和生物發生為基礎，綜述近年來其在病毒感染致病中的研究成果，以期為病毒感染致病機理的研究提供新的切入點。

1 外體的組成

外體是一種細胞內源性的具有雙層膜結構的小囊泡，由蛋白質、脂類和核酸參與構成，其結構和內容物的組分由分泌外體的供體細胞的類型、功能及細胞外的生物學微環境所決定。研究人員應用質譜法、蛋白質免疫印跡法和薄層色譜法等系列方法，對外體的組分進行了分析和鑒定。

外體的蛋白質組分分為兩大類，即遍存于各類型細胞分泌外體的非特異性蛋白和僅存在于某種特定細胞源性外體的特異性蛋白。其中前者是維持外體生物發生、結構及功能的必需蛋白質[3]，例如參與構成細胞骨架的蛋白（肌動蛋白、肌球蛋白重鏈及微管蛋白等）、黏附分子（CD11、CD13、CD18 等）、膜融合相關蛋白（膜聯蛋白和網格蛋白重鏈等）、代謝酶（轉酮醇酶、醛還原酶、ATP 檸檬酸裂解酶等）、分子伴侶（熱激蛋白70、84、90 等）、多囊泡體（multi-vesicular body，MVB）形成蛋白（Alix和Tsg101 等）、T細胞刺激分子（CD86、MHCⅠ和Ⅱ等）等，部分蛋白質組分的功能尚待進一步研究[4]。而后者主要是源自釋放外體的供體細胞中的特異性蛋白，并執行特定的生物學功能，例如來自受感染細胞的包含有病原抗原的外體能夠激活樹突狀細胞（dendritic cell，DC）和巨噬細胞等天然免疫細胞[3]。

人們對于外體中脂質組分的研究結果有限，目前僅對網狀細胞、肥大細胞、DC和B 淋巴細胞所分泌外體的脂質組分做了些許研究。結果表明，外體膜上的脂質主要有鞘磷脂、溶血卵磷脂、飽和脂肪酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇和膽固醇等。由于外體的來源不同，其脂質組分的含量和功能也各不相同，例如溶血磷脂酸是一種對MVB的結構及外體的生物發生都非常重要的脂質[4]。

此外，大量新近研究結果證實，外體還可將mRNA和microRNA（miRNA）從供體細胞運輸至受納細胞，進而調控受納細胞的基因表達和生物學功能[5]。例如，神經元特異高表達的miR-124可借由外體進入星形膠質細胞，上調星形膠質細胞內GLT1蛋白的表達量，促進其對谷氨酸的攝取[6]；嗎啡和人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的Tat 蛋白刺激星型膠質細胞內miR-29 的表達，過多的miR-29 通過外體傳遞至神經元后會造成神經元的損傷[7]。

2 外體的生物發生

細胞內體是動物細胞內由膜包圍的具有囊泡結構的細胞器，是細胞囊泡運輸的樞紐環節和分選中心。外體的生物發生依托于內體，其過程可分為兩個步驟：首先，在內體膜上完成生物大分子的分選；其次，內體通過向腔內反向內陷出芽的方式產生小囊泡，小囊泡逐漸增多聚集后的內體又被稱為MVB，MVB 與細胞膜融合后即可將其內小囊泡即外體釋放進入細胞外間隙[4]。

MVB 的生物發生分為主動和被動兩種方式。主動方式需要許多特定蛋白和脂類分子的參與，例如泛素化是將蛋白分子分選進入MVB 的機制之一。內體分選復合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）系統是真核細胞中完成膜蛋白分揀的重要分子機器，包括ESCRT-0、-Ⅰ、-Ⅱ、-Ⅲ和Vps4-Vta1 共5 個蛋白-蛋白復合物，能識別泛素標記。泛素標記的“待轉運”蛋白分子被轉運到內體膜上，通過ESCRT 系統將含有這些蛋白分子的膜組分分選并內陷出芽形成小囊泡，釋放入內體腔中。MVB形成后，ESCRT系統會從MVB膜上分離，再去參與轉運新的蛋白分子[8-9]。

被動方式是一種不依賴于泛素化的蛋白分子分選機制。蛋白質分子首先聚集，聚集后的蛋白分子會表現出新的物理特性和微結構域，而ESCRT 系統可與微結構域依次發生相互作用，從而將待分選分子轉運進入MVB[10-11]。此外，脂筏中富含的四跨膜蛋白或膽固醇可參與自身的被動分選[10]。

3 外體與病毒感染

受病毒感染的宿主細胞分泌的特異性外體中所包含的功能蛋白、mRNA/miRNA、病原組分等，因病毒類型、病毒的生命周期，以及受感染細胞類型的差異而有所不同。在病毒感染和致病的進程中，外體作為細胞間“通訊”交互的工具可為病毒和宿主同時利用，作為感染致病和抗病毒效應的媒介。

3.1 參與病毒的免疫逃避

哺乳動物雖具有完整的、高度進化的免疫保護系統，有些病毒仍能在其中長期存在。這主要是由于病毒在長期的宿主免疫選擇壓力下產生了多種對抗宿主免疫系統的機制。HIV 的Nef 蛋白不具酶活性，具有銜接蛋白的作用，可下調CD4、主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ和Ⅱ等分子，在對抗宿主免疫應答過程中發揮重要作用。研究發現Nef 可以促進細胞內MVB數量的增加和外體的分泌，同時借助外體促進Nef從受感染細胞運出[12-13]，從而遠程發揮Nef 的功能，例如誘導CD4+T 細胞凋亡[14]。免疫活性細胞上的人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）具有向抗原特異性T 細胞傳遞抗原多肽的生物學特性。1 型單純皰疹病毒（herpes simplex virus-1，HSV-1）編碼的糖蛋白B 可以和HLA-DR 分子形成復合體，改變HLA-DR在細胞內的轉運途徑，使其不能正常轉運至細胞膜，而是通過外體的方式釋放至細胞外，最終抑制了抗原遞呈[15]。Klibi[16]等發現，EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染的鼻咽癌細胞釋放的外體中包含有半乳凝素-9。半乳凝素-9 及其受體Tim-3 信號通路的活化可抑制CD4+和CD8+T 細胞，產生抑制信號，導致Th1 淋巴細胞凋亡和抑制Th1型免疫。EBV通過外體將半乳凝素-9遞送至受納細胞后，可以誘導EBV特異的CD4+T細胞凋亡和抑制Th1型免疫。

3.2 參與病毒的感染和致病

HIV 實現有效感染宿主細胞需要其特異受體CD4 分子和輔助受體CXCR4 或CCR5 的存在，這些受體分子的分布決定了HIV的細胞親嗜性。有研究表明，外體可以將CXCR4 或CCR5 遞送至該受體陰性的受納細胞，從而局部增加了HIV 易感細胞的類型，擴大了HIV的感染范圍，為病毒提供了新的存在場所[17-18]。Kadiu 等[19]通過對HIV-1感染單核細胞源性巨噬細胞分泌外體的組分鑒定，證實其包含有病毒粒子、病毒的組分、細胞因子（IL-3、IL-4、IL-8和TNF-α 等）、抗原遞呈效應分子（HLA-DRA1和HLA-DRB1 等）和黏附分子（fibronectin 等）等，同時功能學研究結果表明外體作為參與者協助了HIV-1的感染及其在機體內的散播。EBV編碼的潛伏膜蛋白1（latent membrane protein 1，LMP1）是一個具有信號轉導能力的癌蛋白。EBV感染的宿主細胞可通過分泌包含LMP1 的外體來激活受納細胞內的ERK和AKT 信號通路，進而影響受納細胞的生長、介導免疫抑制、調節腫瘤微環境[20-21]。Meckes等[20]在EBV感染的B 細胞和未感染的單核細胞來源的DC（monocyte-derived DC，MDDC）共培養的實驗中發現，EBV 編碼的miRNA 出現在MDDC 中，而miRNA遞送是通過外體的途徑來完成的，功能上表現出抑制受納細胞內靶基因的表達（如CXCL11），進而有助于病毒持續性感染的建立。HSV感染細胞分泌的外體可以將病毒的被膜蛋白和糖蛋白等轉運至未感染的受納細胞，其生物學效應包括促進潛伏期病毒的再激活、協助病毒感染半受納型細胞和增加病毒感染成功的幾率等[22]。在丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）的研究中，Ramakrishnaiah 等[23]證實HCV 感染細胞釋放的外體可將病毒的RNA和蛋白遞送至臨近的細胞，并建立增殖性感染。

3.3 參與宿主的抗病毒應答

宿主的抗病毒免疫由非特異性和特異性免疫兩部分組成。前者包括組織屏障、非特異性免疫細胞和非特異性免疫分子；后者由特異性體液免疫和細胞免疫組成。呼吸道分泌的黏液是呼吸道局部非特異性免疫的重要組成部分。研究發現，人的氣管、支氣管上皮細胞所分泌外體的蛋白組成包括了帶有α-2，6 唾液酸修飾的黏蛋白，初步的功能學研究表明該外體可以有效地中和流感病毒，具備非特異性黏膜免疫的生物學功能[24]。滋養層細胞是胎盤屏障的重要組成部分，是胎兒避免宮內感染的重要原因。定位于染色體19q13.41 的miRNA 簇為胎盤專有表達，滋養層細胞可通過外體將該miRNA 簇遞送至受納細胞，通過誘導自噬來弱化病毒在受納細胞內的復制[25]。人胞嘧啶核苷脫氨酶家族的APOBEC3G（A3G）蛋白可誘導HIV的DNA上的胞嘧啶替換為尿嘧啶，導致完整的前病毒數量減少，阻止HIV復制。Khatua 等[26]的研究結果表明，宿主細胞分泌的外體可將A3G 蛋白遞送給受納細胞，并抑制受納細胞內HIV 的復制。此外，在EBV 的研究中發現，源自EBV 轉化B 細胞系的外體包含有EBV 的糖蛋白gp350，由后者和B細胞表面CD21發生相互作用，進而使得外體可特異性地靶向B 細胞，該相互作用可以抑制EBV 對原代B 細胞的感染，具有調控EBV感染的作用[27]。Admyre 等[28]將MDDC 與23 個來自EBV、人巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）和流感病毒的免疫原性多肽共同孵育，后使用培養上清中提取的外體處理自體同源的CD8+T 細胞，結果表明該外體以抗原特異的方式激活了CD8+T 細胞的免疫應答。Walker 等[29]發現，CMV 感染的內皮細胞可以通過外體將病毒抗原遞呈至抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC），激活CMV 特異的CD4+T細胞應答，說明這種源自受感染細胞、具有免疫原性的外體在機體內起到了免疫監視的作用。在流感病毒的研究中同樣發現外體參與了病毒抗原的遞呈過程[30]。

綜上所述，外體在病毒和宿主相互作用的過程中扮演了重要的角色。一方面，病毒可主動借助外體作為載體，利用其分泌途徑，實現免疫逃避、感染的擴散、宿主細胞內的增殖，以及建立持續性感染等；另一方面，宿主細胞也可利用外體來抵抗和限制病毒的感染。因此，理解病毒和宿主外體間的相互影響，不僅能使我們深入洞悉病毒感染致病的分子機制，同時將會為研發新的抗病毒干預措施和疫苗提供新的思路。

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