胃癌和胃癌前病變中NHE1蛋白的表達及其意義

孟 燕 陳 萍 鄧守恒 段 霞

胃癌惡性度高，預后差，早期診治及隨訪極為重要，尋找敏感性和特異性都高的腫瘤標志物具有重要臨床意義。胞膜離子交換蛋白Na+-H+交換泵(Na+-H+exchanger，NHE)是存在于所有真核細胞的一種跨膜蛋白。近年來研究表明，NHE在腫瘤細胞中的活性和mRNA表達水平明顯增高，與腫瘤的發(fā)生有著密切的關系。本研究采用免疫組化的方法探討NHE1蛋白在胃黏膜癌變過程中的變化規(guī)律及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

從我院2008年2月-2012年2月我院收治的各類胃病患者中隨機抽取65例，其中正常胃黏膜患者10例，男性6例，女性4 例，平均年齡36.8 歲；異型增生患者5例，男性3例，女性2例，平均年齡52.8歲；腸上皮化生患者13例，男性8例，女性5例，平均年齡47.4歲；慢性萎縮性胃炎患者12例，男性8例，女性4例，平均年齡43.7歲；胃癌患者25例，男性16例，女性9例，平均年齡58.5歲；高分化腺癌7例，中分化腺癌14例，低分化腺癌4例。所有患者均經(jīng)胃鏡檢查及活檢確診，胃鏡活檢標本均取自胃竇部，胃癌標本均為胃遠端癌。所有標本經(jīng)生理鹽水沖洗干凈后置于液氮罐中保存?zhèn)溆谩Ｋ谢颊咝g前均未接受放、化療。

1.2 方法

所有標本均經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)HE 染色，操作嚴格按照說明書進行。NHE1蛋白表達的檢測采用S-P法。S-P試劑盒及DAB購自北京中山生物公司，小鼠抗人NHE1單克隆抗體購自美國Santa-Cruz公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。染色方法參照試劑盒說明。以PBS 代替一抗作為陰性對照。主要步驟同滕小春等[1]相同。結(jié)果判斷： NHE1蛋白陽性反應物質(zhì)呈棕黃色，主要位于細胞膜及細胞質(zhì)內(nèi)，細胞核不著色。高倍鏡視野下陽性細胞數(shù)占視野10%以下為陰性，10%以上為陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 11.0進行數(shù)據(jù)處理，計算NHE1蛋白陽性率，用χ2檢驗。P<0.05差異為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

在65例標本中，NHE1蛋白在正常胃黏膜中無表達，在胃癌和癌前病變(慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、異型增生)中有不同程度的表達：異型增生5例中有1例表達，陽性率20.00%；腸上皮化生13例中有3例表達，陽性率為23.08%；慢性萎縮性胃炎12例有2例表達，陽性率為16.67%；胃癌25例中有20例表達，陽性率為80.00%。胃癌與正常胃黏膜和各型胃癌前病變相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3 討論

胃癌的發(fā)生是一個進行性發(fā)展的復雜生物過程，研究顯示萎縮性胃炎、腸上皮化生和異型增生是重要的胃癌前病變，與胃癌的發(fā)生、發(fā)展關系密切[2]。

目前對腫瘤細胞NHE1 基因的研究主要在癌細胞株進行，例如在人肝癌細胞株HepG2 中，已檢測到NHE1 mRNA的轉(zhuǎn)錄拷貝數(shù)比正常肝細胞顯著增高[3]，而在胃癌組織中研究較少。滕小春等[1]檢測了NHE1蛋白在胃癌和胃癌前病變中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌的NHE1蛋白陽性率為82.50%，與正常胃黏膜和各型胃癌前病變相比具有顯著性差異(P<0.01)。牛嫣陽等[4]采用RT-PCR和Western blot分別對60例患者胃癌組織中NHE1 mRNA及蛋白表達進行定量檢測，結(jié)果兩者的表達量分別為(0.786+0.291)和(1.442+0.175)，高于癌旁組織的(0.369±0.052)和(0.348±0.029)，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。胃癌組織中NHE1 mRNA表達和NHE1蛋白表達顯著相關。NHE1 mRNA和蛋白表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(P均<0.05)，而與年齡、性別及分化程度無關。

本研究結(jié)果顯示，NHE1 蛋白在胃癌中的表達程度明顯高于胃癌前病變及正常胃黏膜。在慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、異型增生中部分可檢測到NHE1活性的表達，隨著病變程度的增加，NHE1蛋白表達亦有增加的趨勢，提示NHE1活化的細胞，可能是一種癌前細胞。據(jù)此，我們認為，NHE1蛋白的超表達與胃癌的發(fā)生有著密切的關系。這一結(jié)論支持了文獻的觀點。

NHE1主要通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞pHi在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。腫瘤細胞具有代謝旺盛，增殖快的特點，這樣就使得供血、供氧量相對不足，使得腫瘤細胞的葡萄糖攝入量和己糖激酶的活性都增高，導致癌細胞內(nèi)積累大量的乳酸。為了維持細胞內(nèi)堿性環(huán)境，腫瘤細胞必須要有一套高效排出細胞內(nèi)H+的機制。腫瘤細胞正是通過上調(diào)NHE1的表達，排出細胞內(nèi)的H+，維持細胞內(nèi)pH呈堿性。同時，排出的H+也使得細胞外環(huán)境發(fā)生了酸化。這種外酸內(nèi)堿的微環(huán)境對腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移都有著重要作用。最近研究還發(fā)現(xiàn)NHE1的活性與腫瘤細胞偽足的形成有關。偽足對腫瘤細胞的運動、粘附都至關重要，而偽足的形成需要細胞骨架各成分之間一系列的相互作用,NHE1可能是通過調(diào)節(jié)pHi，為細胞骨架各成分之間相互作用提供最適的堿性環(huán)境。這表明NHE1可能直接參與腫瘤細胞偽足形成、運動和粘附過程。

總之，NHE是調(diào)節(jié)腫瘤細胞內(nèi)pHi的重要膜蛋白，當前圍繞NHE1為靶點的研究廣泛興起，其目的是開發(fā)一種新的NHE1抑制劑，為腫瘤治療提供新的方法。因此對胃癌細胞NHE1的研究，將為胃癌的基因治療奠定理論基礎，具有重要的理論意義和實踐意義。

[1] 滕小春，劉海峰，劉永生，等.NHE1蛋白在胃癌和胃癌前病變中的表達及臨床意義〔J〕.第三軍醫(yī)大學學報，2004，26(5)：402-404.

[2] Correa P.Human gastric carcinogenesis：a multistep and multifactorial process-first American Cancer Society award lecture on cancer epidemiology and prevention〔J〕.Cancer Res，1992，52(24)：6735-6739.

[3] Strazzabosco M，Poci C，Spirli C，et al.Intracellular pH regulation in hepG2 cells：effects of epidermal growth factor，transforming growth factor-alpha and insulinlike growth factor on Na+-H+exchange activity〔J〕.Hepatology，1995，22(2)：588-597.

[4] 牛嫣陽，余佩武，唐 波，等.Na+-H+交換泵1在胃癌組織中的表達及其臨床意義〔J〕.中華胃腸外科雜志，2010,13(8)：604-607.