惡性胸腔積液中腫瘤細胞及其相關因子的檢測及應用

馬雪曼綜述 張培彤審校

胸腔積液是惡性腫瘤臨床常見的并發癥之一，幾乎所有的惡性腫瘤(除原發腦腫瘤)均可以引起胸腔積液。在成人胸腔積液中，我國報告25%～30%為癌性胸腔積液，國外報告為25%～53%[1]。因此其良惡性的鑒別至關重要，而鑒別的關鍵在于胸腔積液中是否存在腫瘤細胞。腫瘤細胞的浸潤在惡性胸腔積液的產生中起著重要作用，同時它也是多種惡性腫瘤診斷與鑒別診斷的重要依據[2]。除此之外，胸腔積液腫瘤細胞相關的因子檢測在胸腔積液臨床診療中亦有重要的指導意義。由于胸腔積液的成分比較復雜，其中腫瘤細胞的數量較少，為胸腔積液良惡性的鑒別帶來了困難，同時胸腔積液中各種相關成分的臨床意義有待闡明。

1 胸腔積液腫瘤細胞的富集方法

胸腔積液腫瘤細胞的富集方法從最初的密度梯度離心法不斷改進，引入了新的技術和儀器，其特異性、敏感性、有效性都得到了提高。1983年Nagasawa等[3]首次將密度梯度離心法應用于胸腔積液腫瘤細胞的富集，這種分離過程既簡單易行又高效，即用三密度層(1.050，1.080和1.124 g/ml)Percoll不連續密度梯度分離液對肺癌患者的胸腔積液進行細胞分離，離心后惡性細胞高度富集在1.050 g/ml的細胞層，位于1.080 g/ml的細胞層主要是白細胞和小部分腫瘤細胞，所有的紅細胞分布于1.124 g/ml層。有學者[4]在密度梯度離心法的基礎上進行改進，使用二次離心法對肺癌胸腔積液中的腫瘤細胞進行分離，初次分離的細胞經過孵育后再分離能提高腫瘤細胞的純度，二次分離方法采用不同濃度的 percoll 液進行分離，在淋巴細胞幾乎被除去的同時可有效濾除凋亡及死亡細胞，提高腫瘤細胞的活力。近年來，半自動激光捕獲顯微切割技術被引入到胸腔積液轉移性肺腺癌細胞的檢測和富集，此項技術在選擇腫瘤細胞時有較高的靈敏度，因其是半自動的，所以僅需要最低限度的人工技術監督[5]。Yang 等[6]應用免疫磁珠法對惡性胸腔積液腫瘤細胞進行了陰性富集，將DAPI標記的A549細胞添加到20 ml心衰患者的胸腔積液中，腫瘤細胞回收率為81%，而利用密度梯度離心法的腫瘤細胞回收率僅為61%，其效率遠低于免疫磁珠法。在國內外學者對富集方法的不斷改進下，胸腔積液腫瘤細胞的獲得率及獲得數量得到有效提高，同時達到了純化腫瘤細胞的目的，而高科技方法的引入也使得這一過程簡便易行。

2 胸腔積液腫瘤細胞及其相關因子在惡性腫瘤診斷中的應用

2.1 細胞學診斷

在胸腔積液的良惡性鑒別中細胞學診斷是最常用的方法，為證明該方法的有效性，Segal 等[7]通過一項歷時20年的調查，面向6285名胸腔積液患者，其中815例診斷為癌性胸腔積液，在癌性胸腔積液中517例完成了胸腔積液細胞學診斷(63%)，377/517例進行了病理學明確診斷，得出胸腔積液標本細胞學診斷絕對靈敏度為73%。因此我們可以認為胸腔積液標本細胞學診斷是1種有效的、微創的、經濟的癌性胸腔積液診斷方法。細胞學診斷的方法包括涂片染色法、免疫熒光法、免疫細胞化學法和基因檢測法。

2.1.1 涂片染色法 通過涂片染色法觀察細胞形態是細胞學診斷的基礎，因其操作簡便、重復性高、成本低廉而被普遍使用。梁家銀等[8]對病因不明的439例胸腔積液進行了細胞學檢查，用胸腔積液沉淀物涂片做HE染色和瑞氏染色，共查出惡性腫瘤118例，陽性檢出率為62.8%。在118例中，腺癌96例，占 81.63%；鱗癌4例，占3.93%；分類不明癌15例，占12.17%；其它惡性腫瘤3例，占2.45%。胸腔積液惡性腫瘤細胞中腺癌占大多數。胸腔積液中腺癌細胞陽性檢出率女性明顯高于男性。瑞氏染色和HE染色結合不僅可正確分別細胞學類型，而且可以最大限度地降低診斷的假陰性。楊茂省等[9]回顧性分析胸腔積液直接分類法和離心涂片染色分類法在臨床應用中的不同價值，結果采用直接分類法檢測的918例胸腔積液標本，均未檢出腫瘤細胞；采用染色分類法檢測1405例胸腔積液標本，83例檢出腫瘤細胞，并得到臨床確診，由此可以認為，對于胸腔積液的常規檢查采用離心涂片染色分類法比直接分類法臨床應用價值更高，不僅能區分結核性和化膿性胸膜炎，且能對良、惡性腫瘤早發現、早診斷。

2.1.2 免疫熒光法 免疫熒光法是1種通過細胞表面特異性抗原來識別腫瘤細胞的方法，用熒光染料對細胞染色后，特異性抗原能在熒光顯微鏡下發出熒光。蘇明權等[10]采用吖啶橙熒光法(AOF) 、免疫熒光法(IGF) 、血卟啉熒光法(HOF) 檢測胸腔積液腫瘤細胞，結果 11例乳腺癌中3種方法的陽性率均為100%，42例肺癌陽性率分別為95.2%、95.2%、92.8%，68例肺結核陽性檢出率分別為 4.41%、2.94%、1.47%，18 例肺部感染陽性檢出率分別為1.11%、0.55%、0，5例自發性液氣胸和5例慢性肺源性心臟病均為陰性，由此證明，3種熒光法在診斷良惡性胸腔積液及胸腔積液腫瘤細胞類型方面都有較高的臨床價值，但對良性胸腔積液類型的檢出率卻很低。

2.1.3 免疫細胞化學法 Ensani 等[11]采用免疫細胞化學的方法將3個間皮細胞抗體(D2-40，calretinin和WT-1)和2個非間皮細胞抗體(MOC-31和EMA)用于評估胸腔積液中的惡性細胞，結果發現D2-40的敏感性和特異性均達到100%，被認為可以作為鑒別間皮和非間皮起源細胞的一個準確標記。Sawangpanich等[12]對胸腔積液標本采用了細胞學檢查顯示惡性有小圓藍細胞，免疫細胞化學法顯示波形蛋白陽性反應，結合逆轉錄聚合酶鏈反應法(RT-PCR)證實存在PAX/CD56 FKHR融合轉錄本，成功為一位泰國患者確診了腺泡狀橫紋肌肉瘤。

2.1.4 基因檢測法 抑癌基因和促癌基因的激活與失活在癌癥的發展中起著重要作用，因此胸腔積液細胞的基因檢測有助于胸腔積液的良惡性診斷。Li等[13]探討了脆性組氨酸三聯體(FHIT)及p16 mRNA的缺失、K-ras基因突變在良惡性胸腔積液中的診斷價值，50例惡性胸腔積液患者和30例良性胸腔積液患者參加了這項研究，研究對所有胸腔積液標本進行平行的細胞學評價，用PCR法進行基因檢測，結果發現FHIT和p16 mRNA在惡性胸腔積液患者中缺失率明顯高于良性胸腔積液患者，K-ras突變比良性胸腔積液更頻繁，而這3個基因標記組合的敏感性達到74%，因此基因檢測可對惡性胸腔積液的細胞學診斷起到輔助作用。K-ras基因的突變與人類肺癌的發病機制有關，并被認為是影響預后的重要因素，其突變的位點受到國內外學者的關注。有學者就此問題進行了一項針對40例胸腔積液患者的研究[14]，對胸腔積液標本使用PCR技術檢測了K-ras基因密碼子的點突變，研究表明，胸腔積液可以有效地作為一個搜索癌基因點突變的臨床標本，K-ras基因的第12位密碼子突變在惡性胸腔積液中容易檢測到，對惡性胸腔積液的診斷有重要的啟示作用。抗脫落凋亡被認為是腫瘤轉移的1個重要原因，惡性胸腔積液中的腫瘤細胞被認為具有抗脫落凋亡能力，有學者[15]檢測TC-1基因在胸腔積液腫瘤細胞中表達水平明顯高于原發灶腫瘤細胞，應用TC-1通路相關抑制劑PD176074可促使懸浮著的胸腔積液腫瘤細胞出現大批凋亡及壞死，而PD176074對貼壁培養的原發灶腫瘤細胞則無影響，由此證明了TC-1基因在胸腔積液腫瘤細胞抗脫落凋亡中扮演著重要角色。

2.2 胸腔積液相關因子檢測的輔助診斷功能

目前惡性胸腔積液的細胞學診斷雖然被普遍使用，但其陽性率僅為40%～70%，那些細胞學檢查陰性的患者尚不能被排除惡性的可能，良惡性的判斷對治療及預后起著決定性的作用，因此在鑒別良惡性胸腔積液方面僅僅依靠細胞學診斷是不夠的。許多學者提出應在細胞學診斷的基礎上結合多種輔助診斷項目來提高惡性胸腔積液的檢出率，如胸腔積液腫瘤標志物、生化及血管內皮生長因子[16]等。

2.2.1 胸腔積液腫瘤標志物 腫瘤標志物作為診斷惡性腫瘤較敏感的指標被廣泛應用于臨床，以胸腔積液為臨床標本的腫瘤標志物檢測在鑒別良惡性胸腔積液方面具有較好的診斷價值。有學者[17]研究了腫瘤標志物在肺腺癌相關的細胞學陰性的胸腔積液中的診斷價值，選取HER-2/neu、CYFRA 21-1、和癌胚抗原(CEA)為檢查指標，以74例肺腺癌胸腔積液(細胞學陽性41例，陰性33例)和99例良性胸腔積液為研究對象，結果HER-2/neu、CYFRA 21-1、CEA平均水平在癌性胸腔積液中顯著高于良性者，在細胞學陰性的癌性胸腔積液中CEA聯合CYFRA 21-1的診斷敏感性增加66.7%，在良性胸腔積液中這些標志物的平均假陽性率僅為2.7%，此項研究有力地證明了胸腔積液腫瘤標志物的診斷價值。臨床中通常以血清為標本來測量腫瘤標志物，為驗證胸腔積液在此方面的診斷價值，有學者[18]對28例癌性胸腔積液患者和30例良性胸腔積液患者分別進行血清和胸腔積液中腫瘤標志物(CEA、CA125、CA199、CA153等)的檢測，結果顯示癌性胸腔積液患者血清和胸腔積液中腫瘤標志物均明顯高于良性胸腔積液患者，而在癌性胸腔積液患者中，胸腔積液腫瘤標志物亦顯著高于血清腫瘤標志物。分析其原因可能為在惡性胸腔積液時，腫瘤細胞已侵犯胸膜，癌細胞直接將腫瘤標志物釋放至胸腔內，且胸膜腔內的大分子標志物不易入血，而入血的腫瘤標志物也易被肝臟滅活，所以它在胸腔積液中的濃度顯著高于血清。如果血清內腫瘤標志物水平明顯升高，則可推斷疾病可能已進入中晚期，因此測定胸腔積液中的腫瘤標志物對胸腔積液的早診斷、早治療更有意義。

2.2.2 胸腔積液生物標志物 胸腔積液中富含種類繁多的生物標志物，其中一些與腫瘤細胞密切相關，國內外學者進行了大量實驗及臨床研究以探尋某些生物標志物與惡性胸腔積液的因果關系。Psallidas 等[19]研究了分泌型磷酸化蛋白1(SPP1)對惡性胸腔積液的影響，結果表明SPP1能引起巨噬細胞浸潤到腫瘤、促進腫瘤血管生成，減少癌細胞在體內的凋亡，此外，它可以獨立于血管內皮生長因子直接促進血管通透性增高。我們可以認為SPP1以1種協同的方式促進胸腔積液的積聚與腫瘤的播散，SPP1可能成為治療干預惡性胸腔積液的一個有吸引力的靶標。載脂蛋白E(APOE)已被證明在非小細胞肺癌患者胸腔積液中明顯升高，然而胸腔積液ApoE在NSCLC的診斷價值尚未得到很好的驗證，因此有學者通過實驗來評估其診斷價值，結果發現APOE在診斷NSCLC時靈敏度和特異性分別為70.8%和83.30%，證明胸腔積液中APOE濃度的增加是診斷以及鑒別診斷NSCLC的一個潛在標記[20]。血清降鈣素原(S-PCT)作為全身性細菌感染的生物標志物被眾所周知，然而近期有學者發現胸腔積液降鈣素原(PF PCT)檢測有助于鑒別結核性胸膜炎引起的胸腔積液和惡性胸腔積液[21]。最新發現[22]凝集素芯片可以用于確定肺癌患者的胸腔積液細胞蛋白譜，其中SNA有最高的敏感性(92.6%)、特異性(100%)和準確性(96.3%)，SNA可以作為生物標志物來鑒別反應性間皮細胞與腺癌細胞，從而證明凝集素芯片能夠在胸腔積液中區分間皮細胞中的癌細胞。

2.2.3 其他胸腔積液相關因子檢測 以胸腔積液為標本的檢測越來越趨于多元化，除了細胞學檢測、胸腔積液腫瘤標志物、生物標志物等檢查外，許多新的項目受到廣大學者及醫務工作者的關注，這些項目雖然尚不成熟，但有望為惡性胸腔積液的診斷提供新的工具和思路。已有學者[23]證實染色體分析技術在惡性胸腔積液鑒別中具有靈敏度高、特異性強、成本低、易在基層醫院推廣的特點，對于臨床上難以鑒別性質的胸腔積液患者，在進行細胞學檢查的同時聯合染色體分析可以大大提高惡性胸腔積液的檢出率。有學者[24]為探究血清鐵蛋白與胸腔積液鐵蛋白檢測對良惡性胸腔積液的診斷價值進行了臨床研究，發現胸腔積液鐵蛋白檢測有助于良惡性胸腔積液的鑒別診斷，～ 而血清鐵蛋白檢測對良惡性胸腔積液的鑒別診斷價值不大。腫瘤血管生成在腫瘤的復發轉移中起著重要的作用，研究發現[25]CD31、CD34、CD105 及VEGF 在非小細胞肺癌胸腔積液中的表達量明顯高于增生和炎性胸腔積液表達，檢測胸腔積液細胞中血管內皮標記物及血管內皮生長因子的表達水平可能對判斷患者的預后有一定價值。表皮生長因子受體(EGFR)基因突變的非小細胞肺癌患者對吉非替尼敏感，因此，EGFR突變檢測在治療決策中起著重要作用，最初這項檢測主要涉及標準的腫瘤組織樣本，近期細針穿刺所得和胸腔積液中的腫瘤細胞也可成功地為EGFR基因突變提供靈敏的檢測素材，使EGFR基因突變的檢測在臨床中更為快速和普及[26]。

胸腔積液中腫瘤細胞的相關研究為惡性胸腔積液的診斷提供了新的方法和靶點，胸腔積液相關因子檢測在臨床診斷中亦具有很大的指導意義。

[1] 石遠凱.肺癌診斷治療學〔M〕.北京： 人民衛生出版社，2008：337-341.

[2] Casciato DA，Territo MC.Manual of Clinical Oncology〔M〕.Philadelphia：Lippincott Williams & Wilkins，2009：613-614.

[3] Nagasawa T， Nagasawa S.Enrichment of malignant cells from pleural effusions by Percoll density gradients 〔J〕.Acta Cytol，1983，27(2)：119-123.

[4] 顏秉陽，殷國強，張志培，等.肺腺癌胸水腫瘤細胞分離與體外懸浮培養及鑒定〔J〕.現代腫瘤醫學，2012，20(9)：1844-1848.

[5] Roy Chowdhuri S，Hanson J，Cheng J，et al.Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples〔J〕.Acta Cytologica，2012，56(6)：622-631.

[6] Yang JJ，Xu XX， Min LF，et al.The negative enrichment by immunomagnetic beads for tumor cellsfrom malignant pleural effusions 〔J〕.Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi，2012，35(9)：673-678.

[7] Segal A，Sterrett GF，Frost FA，et al.A diagnosis of malignant pleural mesothelioma can be made by effusion cytology：results of a 20 year audit〔J〕.Pathology，2013，45(1)：44-48.

[8] 梁家銀，劉 文，孔維順.118例惡性腫瘤胸腔積液細胞學檢查結果分析 〔A〕.結核與肺部疾病論文集〔C〕.2006：241-242.

[9] 楊茂省，王 娟，萬利改，等.胸腔積液細胞分類檢查采用直接分類法與染色分類法的結果分析及臨床意義〔J〕.中國實用醫藥，2013，8(5)：93-93.

[10] 蘇明權，丁振若，于文彬，等.熒光法對胸水腫瘤細胞的鑒別診斷〔J〕.西北國防醫學雜志，2000，21(4)：306-307.

[11] Ensani F，Nematizadeh F，Irvanlou G.Accuracy of immunohistochemistry in evaluation of malignant pleural and peritoneal effusions〔J〕.Pol J Pathol，2011，62(2)：95-100.

[12] Sawangpanich R，Larbcharoensub N，Jinawath A，et al.Detection of alveolar rhabdomyosarcoma in pleural fluid with immunocytochemistry on cell block and determination of PAX/FKHR fusion mRNA by reverse transcription-polymerase chain reaction 〔J〕.J Med Assoc Thai，2011，94(11)：1394-1398.

[13] Li J， Bao QL，Wang Y，et al.Diagnostic value of the FHIT and p16 mRNA loss and the K-ras gene mutation in pleural fluids for malignant pleural effusion 〔J〕.Cancer Biomark，2013，13(1)：49-58.

[14] Nakamoto M，Teramoto H，Matsumoto S，et al.K-ras and rho A mutations in malignant pleural effusion〔J〕.Int J Oncol，2001，19(5)：971-976.

[15] 顏秉陽.TC-1的表達水平與肺腺癌胸水腫瘤細胞抗脫落凋亡的相關性研究〔D〕.第四軍醫大學，2012.

[16] Rodriguez-Panadero F，Romero-Romero B.Current and future options for the diagnosis of malignant pleural effusion〔J〕.Expert Opin Med Diagn，2013，7(3)：275-287.

[17] Hsieh TC，Huang W，Lai CL，et al.Diagnostic value of tumor markers in lung adenocarcinoma-associated cytologically negative pleural effusions 〔J〕.Cancer Cytopathol，2013，121(9)：483-488.

[18] 謝昭寧.胸腔積液腫瘤標志物在良惡性胸腔積液鑒別診斷中的價值〔J〕.檢驗醫學與臨床，2013，10(7)：852-854.

[19] Psallidas I，Stathopoulos GT， Maniatis NA，et al.Secreted phosphoprotein-1 directly provokes vascular leakage to foster malignant pleural effusion 〔J〕.Oncogene，2013，32(4)：528-535.

[20] Wang Y，Chen Z，Chen J，et al.The diagnostic value of apolipoprotein E in malignant pleural effusion associated with non-small cell lung cancer 〔J〕.Clin Chim Acta，2013，421：230-235.

[21] Lee SH，Lee EJ，Min KH，et al.Procalcitonin as a diagnostic marker in differentiating parapneumonic effusion from tuberculous pleurisy or malignant effusion〔J〕.Clin Biochem，2013，46(15)：1484-1488.

[22] Shi YQ，He Q，Zhao YJ，et al.Lectin microarrays differentiate carcinoma cells from reactive mesothelial cells in pleural effusions〔J〕.Cytotechnology，2013，65(3)：355-362.

[23] 袁 青，徐瑞龍.染色體分析、細胞學檢查及腫瘤標志物檢測在惡性胸腔積液鑒別中的聯合應用價值〔J〕.檢驗醫學，2006，21(5)：538-540.

[24] 楊大勇，尹志永，柴寶英，等.血清與胸水鐵蛋白檢測對良惡性胸腔積液的診斷價值〔J〕.中國誤診學雜志，2009，9(7)：1530-1530.

[25] 杜明偉，方長青，王秀茹，等.血管內皮標記物及血管內皮生長因子在胸水細胞中的表達和意義〔J〕.微生物學雜志，2012，32(4)：47-52.

[26] Ellison G，Zhu G，Moulis A，et al.EGFR mutation testing in lung cancer：a review of available methods and their use for analysis of tumour tissue and cytology samples 〔J〕.J Clin Pathol，2013，66(2)：79-89.