IL-24與蛋白激酶和eIF-2α在膠質瘤中的表達

胡長偉 尹港峰 王希瑞 白慶齡 呂艷明 趙文清 李文玲

IL-24是一種新發現的具有抗腫瘤作用的細胞因子，系IL-10家族成員。IL-24是一種具有細胞因子特性和抑瘤因子功能雙重功效的蛋白質。正常生理濃度的IL-24可能是調節免疫反應，而在超生理濃度下會顯示非常好的抗腫瘤特性。目前認為IL-24發揮抑癌作用主要是通過調節腫瘤細胞的凋亡信號通路促進腫瘤凋亡。但對于IL-24具體抑制腫瘤細胞凋亡的機制尚不明確。本文通過熒光定量PCR及免疫組化技術初步探討IL-24可能通過蛋白激酶(PKR)、真核細胞翻譯起始因子(eIF-2α)影響膠質瘤細胞凋亡。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009年1月至2009年12月滄州市中心醫院神經外科手術切除膠質瘤標本腫瘤組30例，所有膠質瘤標本均進行HE染色，常規病理檢查并按WHO 2007年腦腫瘤分類標準分類:Ⅰ～Ⅱ級9例;Ⅲ級11例均為間變性星形細胞瘤;Ⅳ級膠質母細胞瘤10例。其中，男18例，女12例;平均年齡(43±19)歲。正常腦組織對照組標本均來自外傷患者內減壓手術，共7例。

1.2 檢測方法

1.2.1 熒光定量 PCR:將膠質瘤組織及細胞中的RNA提取后，經分光光度儀檢測與定量(要求OD260/OD280比值為1.8～2.0)。反轉錄后加入GAPDH、IL-24或PKR、eIF-2α的引物后置于7300 HT熒光定量PCR儀上進行PCR擴增。PCR完成后，在ABI 7300 System SDS Software SDS1.3.2.10 軟件上分析，并計算基因相對表達量。引物由上海生物工程公司合成。

1.2.2 免疫組化:將膠質瘤及正常腦組織標本石蠟包埋切片用作檢測其中IL-24及PKR、eIF-2α的表達。標本切片常規脫蠟脫水后，一抗(IL-24和PKR、eIF-2α抗體購自美國Promega公司)以1∶100濃度4℃孵育24 h，PBS替代一抗作為陰性對照。然后二抗以1∶100濃度(購自美國Sigma公司)37℃孵育30 min。應用ABC法和DAB顯色，蘇木素復染，封片后顯微鏡下檢測。從染色反應陽性細胞數及陽性強度兩方面進行綜合判斷評分。評分標準:無陽性細胞為0分，＜20%為1分，20% ～39%為2分，40% ～69%為3分，＞70%為4分。染色強度以多數細胞為準，評分標準:染色陰性0分，淡棕黃色1分，深棕黃色2分，深棕褐色3分。將陽性細胞百分率與染色強度二者得分相加得到總積分，取每個標本3張切片總積分的均值，作為該標本研究指標的平均表達值，用于統計分析。

1.3 統計學分析 應用SPSS 11.5統計軟件，計量資料以表示，采用單因素方差分析，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-24在膠質瘤組織中的表達 用熒光定量PCR和免疫組化的方法檢測各標本中IL-24 mRNA及蛋白的表達情況，發現膠質瘤中IL-24表達較正常腦組織明顯降低，且隨膠質瘤級別的增加，其表達逐漸降低。見圖1。

圖1 免疫組化檢測IL-24、PKR、eIF-2α在各級別膠質瘤中的表達

2.2 PKR、eIF-2α在膠質瘤組織中的表達 應用熒光定量PCR和免疫組化的方法檢測各標本中PKR、eIF-2α的 mRNA及蛋白的表達情況，發現PKR、eIF-2α在膠質瘤中的表達較正常腦組織明顯降低，也隨膠質瘤級別的增加，其表達逐漸降低。見圖2。

圖2 熒光定量PCR檢測各級別膠質瘤中IL-24、PKR、eIF-2α的mRNA的表達

3 討論

腦膠質瘤是顱內最常見的原發性中樞神經系統惡性腫瘤。膠質瘤呈浸潤性生長，無明顯界限，目前多采用以手術為主，結合放療、化療的綜合治療。而臨床治療中手術很難完全切除，化療和放療既不能高度特異性地殺傷膠質瘤細胞，治療效果差，又可能產生中樞神經系統，乃致全身不能耐受的毒、副作用。目前研究發現IL-24可以選擇性殺傷許多腫瘤細胞(包括肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等)，而不損傷正常細胞［1－3］。IL-24 是目前研究較廣泛的一種腫瘤抑制因子，其在多種腫瘤中的抗癌特性已被驗證。膠質瘤的發生發展與多種細胞因子的異常表達有關，目前認為膠質細胞中抑癌基因的突變會造成抑癌因子表達的下調或缺失，從而引發一系列的細胞信號通路的改變，并最終引發細胞的癌變，成為膠質瘤細胞。最近，Yacoub 等［4，5］研究發現IL-24可發揮一定的膠質瘤細胞抑制作用，并提高膠質瘤細胞的放療易感性。但目前關于IL-24與人腦膠質瘤發生發展的關系及IL-24對膠質瘤作用的具體機制尚不明確。本研究發現在膠質瘤中IL-24的表達降低，且膠質瘤惡性程度越高，IL-24表達越低，與膠質瘤惡性程度相關，說明IL-24的表達對膠質瘤可能有一定的抑制作用。

我們還發現膠質瘤組織中PKR的表達比正常腦組織明顯降低。PKR是一種調節細胞凋亡的蛋白分子，目前發現PKR的活化可介導多種腫瘤細胞的凋亡增加，從而發揮抗腫瘤特性［6］。PKR即雙鏈RNA依賴性蛋白激酶，是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，是干擾素所介導的抗病毒以及促使細胞凋亡功能的主要調解因子之一，它參與多種刺激因子所介導的凋亡［7］。PKR基因定位于人染色體2p21-2，PKR基因是由一個含有許多潛在調控元件的啟動子所轉錄，通過兩個雙鏈RNA綁定區域被激活［8］。激活的PKR可以調控多個下游靶位，其中包括 eIF-2α，NF-κB，可以抑制蛋白的合成，最后抑制細胞的生長和促進細胞凋亡［9－12］。我們發現膠質瘤組織中PKR、eIF-2α的表達比正常腦組織明顯降低，與IL-24相同的隨膠質瘤級別的增加而降低。說明IL-24的表達與膠質瘤的惡性程度有關，并且IL-24可以通過調控PKR、eIF-2α的表達，進而影響膠質瘤細胞的凋亡。

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9 Saelens X，Kalai M，Vandenabeele P.Translation inhibition in apoptosis:caspase-dependent PKR activation and eIF2-α phosphorylation J Biol Chem，2001，276:41620-41628.

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