基于微流控熒光定量PCR的MRSA快速檢測技術研究

李陽　朱靈　朱燦燦　趙樹彌　張龍　鄧國慶　劉勇　王安

[摘 要] 針對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）檢測的問題，發展一種基于微流控熒光定量PCR的致病菌快速檢測新技術。采用光刻法制作了微流控PCR芯片，研制了集成高性能溫度控制模塊和高靈敏度熒光檢測模塊的微流控熒光定量PCR分析系統。通過檢測特異性基因femA和mecA對MRSA進行快速鑒別。實驗結果表明，使用微流控PCR芯片可以成功實現MRSA特異性基因的快速檢測，相對傳統的管式PCR，芯片使用6 ?L試劑在56 min完成了MRSA特異基因的檢測，不僅節約了反應試劑，而且極大提高了檢測速度。該技術可擴展到其他致病菌的檢測，具有良好的應用前景。

[關鍵詞] 微流控芯片；熒光定量PCR；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；快速檢測

中圖分類號：TB99 R378.1 文獻標識碼：A 文章編號：2055-5200（2014）02-006-03

前 言

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus Aureus， MRSA）是引起院內感染的主要病原菌之一，MRSA具有耐藥性和致病能力強的特點易引起交叉感染，極大地增加了臨床治療難度 [1]。 MRSA檢測的常用方法有紙片擴散法、瓊脂稀釋法、PCR擴增電泳法等[2-4]，但是這些方法耗時長、需要樣本量多、實驗成本高、操作復雜。因此，研究針對MRSA的快速、準確檢測方法具有重要意義。

研究發現，femA基因是金葡菌攜帶的特異性基因，而MRSA的耐藥性是由于其攜帶的mecA基因編碼對β-內酰胺類抗菌藥物低親和力的青霉素結合蛋白（PBP2a）而產生的。使用PCR方法同時檢測femA和mecA基因可提高MRSA鑒別的特異性[5]。管式熒光定量PCR方法進行金葡菌的檢測需要2個多小時的時間[6-7]，微流控技術通過微加工工藝在芯片上制作微型PCR反應腔，可極大減少PCR反應體系，節約試劑，提高升降溫速度，從而實現快速檢測[8-9]。

本文采用光刻法制作了PDMS微流控PCR芯片，在自主研發的集成高性能溫度控制模塊和高靈敏度熒光檢測模塊的微流控熒光定量PCR分析系統上實現了MRSA的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

實驗所用的儀器及試劑：勻膠機（中科院微電子所 KW-4A型）；紫外曝光機（美國Uvitron International公司 INTELLI-RAY 400型）；微電腦加熱板（PERSDER公司）；SU8 2150光刻膠（美國MicroChem公司）；等離子體清洗機（美國Harrick Plasma公司 PDC-32G型）；PDMS（Dow Corning公司 Silgard 184）；TEC （富連京公司 FPH1-19912ACS1型）；MRSA試劑盒（寧波基內公司）。

研究中使用的PCR平臺是自主研制的微流控熒光定量PCR系統，該系統的結構原理圖如圖1所示。系統包括溫度控制模塊、熒光檢測模塊和計算機。溫度控制模塊由半導體制冷片、散熱器及風扇組成，結構如圖2所示。半導體制冷片（Thermoelectric Cooler，TEC）具有加熱和制冷兩種功能，熱管鰭片式高性能散熱器以及風扇是將TEC 產生的熱量充分散發至周圍環境中，通過優化設計后的溫度控制算法可實現溫度的精確控制[10]。

熒光檢測模塊利用LED作為激發光源，通過CCD（ICX412，SONY公司）對PCR過程所發出的熒光信號進行收集，傳輸到計算機中進行分析處理。

1.2 芯片結構與加工

微流控芯片如圖3所示包含兩層結構，上層是通過光刻方法制作的PDMS基片，利用氧等離子體與下層的玻璃板鍵合。硅片上陽模板的制作：2英寸的硅片利用等離子體清洗后涂以光刻膠，先500 r/min勻膠10 s，再1700 r/min勻膠30 s；前烘過程的溫度設置為65 ℃→95 ℃→65 ℃，三個階段的時間分別為8 min，80 min和10 min；在紫外曝光機中曝光15 s；后烘的溫度設置為65 ℃→95 ℃→65 ℃，時間為5 min，25 min和5 min；硅片與顯影液（丙酮）中超聲顯影15 min，顯影后晾干備用。

圖1 微流控熒光PCR平臺結構圖

圖2 溫度控制結構圖

將PDMS與固化劑按照質量比10：1進行混合，攪拌均勻，經抽真空后倒在微流控芯片模板上，置于微加熱板上85 ℃固化1h；自然冷卻后，將PDMS基片從模板上剝離下來，在反應腔的兩端引流通道打孔；將打孔后的PDMS基片與玻璃基板用等離子體進行鍵合；鍵合好的芯片進行高溫高壓滅菌處理，再烘干。

圖3 微流控芯片結構圖

1.3 微流控PCR實驗

PCR反應試劑按照PCR試劑盒說明進行配制。20.2 ?L的反應體系包括18 ?L的MRSA耐藥基因核酸熒光PCR檢測混合液與0.2 ?L酶（Taq+UNG）以及2 ?L的DNA模板（濃度為0.4 ng/?L）。從20.2 ?L的體系中抽取6 ?L注入微流控芯片中，密封芯片。在微流控熒光PCR平臺上進行PCR反應。條件設置如下：37 ℃運行2 min，94 ℃預變性2 min；然后進行PCR擴增，93 ℃變性12 s，60 ℃延伸45 s，循環40個周期。

2 結果與討論

我們對PCR循環過程中微流控芯片反應腔內部的溫度和TEC的溫度進行了測定，所得到的結果如圖（4）所示。從圖中可以看出，TEC通過分段超前校正算法進行控制，從而使芯片中的PCR試劑能夠實現快速的升降溫。目前，平均升降溫速率達到7.48 ℃/s，其中升溫速率為11.25 ℃/s，降溫速率為5.08 ℃/s。管式熒光定量PCR儀，其負載的升降溫速率為2℃/s，單次實驗需要2h以上才能完成整個PCR反應。本研究利用微流控熒光PCR的方法，56 min就完成了MRSA的檢測，反應時間縮短至1h以內，主要原因在于快速的升降溫速度使得PCR循環中各個溫區之間切換時間大大縮短。

圖4 PCR溫度循環中芯片內部溫度和TEC的溫度曲線

將濃度為0.4 ng/?L的MRSA基因工程菌加入6 ?L微流控芯片，進行了5次PCR實驗 ，擴增曲線如圖（5）所示，兩個基因片段的Ct值分別為13.48和18.60，被測基因femA和mecA都有明顯的擴增，可以確認待測樣品即為MRSA陽性樣品。相對于試劑盒推薦使用的40 ?L PCR反應體系，微流控芯片的試劑量縮小至原來的1/6。本研究采用的PDMS芯片制作簡單、成本較低，而且具有很好的生物兼容性，這使得MRSA檢測成本大大降低。同時，針對不同的待測樣本量，使用光刻法可以制作不同通量的微流控PCR芯片，既可對單個樣本進行檢測，又可以同時檢測多個待測樣本，而且通過改變PCR反應腔的大小，甚至能夠實現納升乃至皮升體積的微流體PCR反應。

3 結論

本研究將微流控芯片和熒光定量PCR技術相結合，實現了MRSA的快速檢測。芯片采用高性能溫度控制模塊進行加熱，該溫度控制模塊有較快的升降溫速率，可以減少微流控芯片在升降溫過程中消耗的時間，加快PCR反應速度。微流控PCR芯片反應腔體積和反應腔形狀可以根據實際樣本檢測的需要進行個性化設計，通過MEMS技術PCR反應腔可以縮小至微升級乃至納升級，在同樣大小芯片上可以刻上更多的反應腔，從而提高檢測通量。本方法不僅可以用于致病菌的快速檢測，在其他病原體基因檢測中也有著廣泛的應用。

參 考 文 獻

[1] 楊清宇，劉榮森. 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的研究[J].中華醫院感染學雜志，2004， 14（4）：478-480.

[2] 晏群，鄔靖敏，李軍，等. 6種檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌方法的應用評價[J]. 中國現代醫學雜志，2012，22（026）：65-69.

[3] 張鳳笑，石磊.PCR 技術在金黃色葡萄球菌中的研究進展[J].現代食品科技. 2008，24（10）：1042-1047.

[4] 牟曉峰，趙自云. 實時熒光定量 PCR 檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌方法的建立與應用評價[J].中華醫院感染學雜志.，2011，21（19）：4185-4187.

[5] 陳智鴻，范昕建，呂曉菊. mecA，femA 基因 PCR 聯合擴增法檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[J]. 四川大學學報 （醫學版）： 2003，34（4）：663-666.

[6] 朱以軍，李向陽. 熒光實時 PCR 法檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的研究[J].中華醫院感染學雜志，2007，17（7）：898-900.

[7] 姚李英，陳濤，王升啟等.高聚物基 PCR 微流控芯片技術[J].中國生物工程雜志，2004，24（3）：90-93.

[8] Ramalingam N，Rui Z，Liu HB，et al. Real-time PCR-based microfluidic array chip for simultaneous detection of multiple waterborne pathogens[J]. Sensors and Actuators B： Chemical. 2010，145（1）：543-552.

[9] Qiu X，Mauk MG，Chen D，Liu C，Bau HH. A large volume，portable，real-time PCR reactor[J]. Lab Chip. 2010，10（22）：3170-3077.

[10] 劉勇，高娜，李志剛，等. 基于分段式超前校正的微流控 PCR 溫度控制器[J].傳感器與微系統，2012，31（9）：93-95.

圖4 PCR溫度循環中芯片內部溫度和TEC的溫度曲線

將濃度為0.4 ng/?L的MRSA基因工程菌加入6 ?L微流控芯片，進行了5次PCR實驗 ，擴增曲線如圖（5）所示，兩個基因片段的Ct值分別為13.48和18.60，被測基因femA和mecA都有明顯的擴增，可以確認待測樣品即為MRSA陽性樣品。相對于試劑盒推薦使用的40 ?L PCR反應體系，微流控芯片的試劑量縮小至原來的1/6。本研究采用的PDMS芯片制作簡單、成本較低，而且具有很好的生物兼容性，這使得MRSA檢測成本大大降低。同時，針對不同的待測樣本量，使用光刻法可以制作不同通量的微流控PCR芯片，既可對單個樣本進行檢測，又可以同時檢測多個待測樣本，而且通過改變PCR反應腔的大小，甚至能夠實現納升乃至皮升體積的微流體PCR反應。

3 結論

本研究將微流控芯片和熒光定量PCR技術相結合，實現了MRSA的快速檢測。芯片采用高性能溫度控制模塊進行加熱，該溫度控制模塊有較快的升降溫速率，可以減少微流控芯片在升降溫過程中消耗的時間，加快PCR反應速度。微流控PCR芯片反應腔體積和反應腔形狀可以根據實際樣本檢測的需要進行個性化設計，通過MEMS技術PCR反應腔可以縮小至微升級乃至納升級，在同樣大小芯片上可以刻上更多的反應腔，從而提高檢測通量。本方法不僅可以用于致病菌的快速檢測，在其他病原體基因檢測中也有著廣泛的應用。

參 考 文 獻

[1] 楊清宇，劉榮森. 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的研究[J].中華醫院感染學雜志，2004， 14（4）：478-480.

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[8] Ramalingam N，Rui Z，Liu HB，et al. Real-time PCR-based microfluidic array chip for simultaneous detection of multiple waterborne pathogens[J]. Sensors and Actuators B： Chemical. 2010，145（1）：543-552.

[9] Qiu X，Mauk MG，Chen D，Liu C，Bau HH. A large volume，portable，real-time PCR reactor[J]. Lab Chip. 2010，10（22）：3170-3077.

[10] 劉勇，高娜，李志剛，等. 基于分段式超前校正的微流控 PCR 溫度控制器[J].傳感器與微系統，2012，31（9）：93-95.

圖4 PCR溫度循環中芯片內部溫度和TEC的溫度曲線

將濃度為0.4 ng/?L的MRSA基因工程菌加入6 ?L微流控芯片，進行了5次PCR實驗 ，擴增曲線如圖（5）所示，兩個基因片段的Ct值分別為13.48和18.60，被測基因femA和mecA都有明顯的擴增，可以確認待測樣品即為MRSA陽性樣品。相對于試劑盒推薦使用的40 ?L PCR反應體系，微流控芯片的試劑量縮小至原來的1/6。本研究采用的PDMS芯片制作簡單、成本較低，而且具有很好的生物兼容性，這使得MRSA檢測成本大大降低。同時，針對不同的待測樣本量，使用光刻法可以制作不同通量的微流控PCR芯片，既可對單個樣本進行檢測，又可以同時檢測多個待測樣本，而且通過改變PCR反應腔的大小，甚至能夠實現納升乃至皮升體積的微流體PCR反應。

3 結論

本研究將微流控芯片和熒光定量PCR技術相結合，實現了MRSA的快速檢測。芯片采用高性能溫度控制模塊進行加熱，該溫度控制模塊有較快的升降溫速率，可以減少微流控芯片在升降溫過程中消耗的時間，加快PCR反應速度。微流控PCR芯片反應腔體積和反應腔形狀可以根據實際樣本檢測的需要進行個性化設計，通過MEMS技術PCR反應腔可以縮小至微升級乃至納升級，在同樣大小芯片上可以刻上更多的反應腔，從而提高檢測通量。本方法不僅可以用于致病菌的快速檢測，在其他病原體基因檢測中也有著廣泛的應用。

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[1] 楊清宇，劉榮森. 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的研究[J].中華醫院感染學雜志，2004， 14（4）：478-480.

[2] 晏群，鄔靖敏，李軍，等. 6種檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌方法的應用評價[J]. 中國現代醫學雜志，2012，22（026）：65-69.

[3] 張鳳笑，石磊.PCR 技術在金黃色葡萄球菌中的研究進展[J].現代食品科技. 2008，24（10）：1042-1047.

[4] 牟曉峰，趙自云. 實時熒光定量 PCR 檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌方法的建立與應用評價[J].中華醫院感染學雜志.，2011，21（19）：4185-4187.

[5] 陳智鴻，范昕建，呂曉菊. mecA，femA 基因 PCR 聯合擴增法檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[J]. 四川大學學報 （醫學版）： 2003，34（4）：663-666.

[6] 朱以軍，李向陽. 熒光實時 PCR 法檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的研究[J].中華醫院感染學雜志，2007，17（7）：898-900.

[7] 姚李英，陳濤，王升啟等.高聚物基 PCR 微流控芯片技術[J].中國生物工程雜志，2004，24（3）：90-93.

[8] Ramalingam N，Rui Z，Liu HB，et al. Real-time PCR-based microfluidic array chip for simultaneous detection of multiple waterborne pathogens[J]. Sensors and Actuators B： Chemical. 2010，145（1）：543-552.

[9] Qiu X，Mauk MG，Chen D，Liu C，Bau HH. A large volume，portable，real-time PCR reactor[J]. Lab Chip. 2010，10（22）：3170-3077.

[10] 劉勇，高娜，李志剛，等. 基于分段式超前校正的微流控 PCR 溫度控制器[J].傳感器與微系統，2012，31（9）：93-95.