流感嗜血桿菌外膜蛋白及免疫特性

趙青

流感嗜血桿菌，簡稱嗜血桿菌(haemophilus influenzae，Hi)，該菌是由波蘭細菌學家費佛博士在1892年的一次流行性感冒瘟疫中發現的，發現該菌之初，人們誤以為其是導致流行性感冒的病因，到1933年流行性感冒病毒性病原體被分離出來之后，人們才消除了對此的誤解。Hi可引發肺炎、結膜炎、中耳炎、會厭炎等疾病，其侵襲性的感染可導致腦膜炎和菌血癥等［1］，給人類的健康帶來嚴重的危害，據調查在歐洲流感嗜血桿菌已經成為獲得性肺炎中的第二大病原菌［2］。Hi的人群攜帶率很高，是一些疾病的重要病原菌。該菌疫苗的獲得主要是通過對其外膜蛋白的研究，因此本文主要對常見的外膜蛋白主要從其特性和抗藥機制兩個方面進行詳細介紹，以便日后深入研究該病原體。流感嗜血桿菌，是一類革蘭陰性、需氧或兼性厭氧菌，常定位于局部的呼吸道、中耳、結膜等處，其對生長的環境要求較高，且在人工培養時需加入新鮮的血液，它自身生長主要依賴于Ⅴ和Ⅹ因子。根據有無莢膜其可分為莢膜型和無莢膜型(nontypeable haemophilus influenzae，NTHi)兩種類型。以往的研究指出只有莢膜型菌株可致病，莢膜型又可分為a～f六個血清型，其中又以b血清型(Hib)的侵襲力最強;然而近來的研究多顯示，在感染Hi的患者中最常見的菌株是NTHi，特別是在呼吸道感染中NTHi已成為了主要致病菌［3］，它們首先寄居在鼻咽部，然后通過咽鼓管到達中耳，常引起呼吸道的反復感染。通過研究，Hi外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)常被用做疫苗的研制來防止人類感染此病毒。Hi的外膜蛋白主要有 P6、P2、P26、P5、P4、脂蛋白 D(LPD)、Haps 蛋白、Hia蛋白等。

1 外膜蛋白P6

1.1 P6生物特性 Hlrano等［4］首次分離出外膜蛋白P6(outer membrane protein P6，P6)，證實其存在于所有Hi菌株上，研究指出其免疫交叉反應暴露于細胞表面;P6是一種肽聚糖偶聯的脂蛋白，也是一個整合蛋白，其分子量為16-kDa，在所有外膜蛋白中所占比重僅為1% ～5%［5］，但其作用是不容忽視的;P6蛋白在維持細胞外膜的完整性方面具有重要作用，其錨定于NTHi菌體外膜上，通過對缺乏P6基因表達的NTHi突變體的研究表明，缺乏P6基因表達的菌株生長緩慢，其細胞壁的完整性降低，脆性增加，對β-內酰胺類抗生素具有很強的敏感性［6］;在外膜蛋白中，P6蛋白是唯一一個不溶于37℃、1%SDS-0.5 mmol/L NaCl-0.1% β-巰基乙醇溶液的蛋白，但在60℃時可釋放到細胞外［7］。

1.2 P6免疫特性 P6有殺菌免疫活性。P6有一個Pam半骯氨酸末端模序，與Toll樣受體信號轉導系統偶聯，P6能夠激活TLR2，而TLR2又可激活NF-kB，進而來誘導細胞內信號傳導系統的活化［8］，引起對OMP的獲得性免疫應答。通過菌株的預測氨基酸序列對比表明，多菌株間的序列各不相同，然而P6菌株間的氨基酸序列差異卻不大，由此可見 P6相當保守。通過P6的單抗和多抗血清檢測表明，其基因序列具有高度保守性［9］，在 Hi菌株間的保守性分別為 97%、100%［10］，P6是一個位于流感桿菌表面的高度保守的抗原。

研究顯示P6抗體對機體具有保護性。Demaria等［11］單獨用P6蛋白免疫南美栗鼠并進行細菌的攻擊實驗，實驗發現動物體內產生了較高的抗體，且該抗體具有保護性;這些抗體能夠加速清除NTHi病原菌［12］，使得實驗中動物的恢復速度增快［13］;P6在體液和細胞免疫應答及特異性黏膜免疫應答的誘導中均有重要的作用。

通過利用毛絲鼠動物模型進行的實驗研究表明，當P6、PCP-PAL和P4復合物聯合免疫動物時，動物能產生高滴度抗體，但該抗體卻沒有殺菌活性及免疫保護性，這可能是因為P6在單獨免疫時形成了的二聚體受復合物的影響使得P6蛋白質的構象發生了改變，因此屏蔽了具有保護性的抗原表位，這也從另一個側面表明P6蛋白的構象在機體產生有效抗體中扮演著重要的角色。

1.3 P6蛋白的應用 由于P6抗原的高度保守性，可疫苗研制中起十分重要作用，也是目前最有前景的疫苗候選菌株。基于P6基因的高度保守性，可用于鑒別流感嗜血桿菌及溶血性嗜血桿菌［14］。通過利用P6基因設計引物，用PCR檢測極大的提高陽性率。

2 外膜蛋白P2

2.1 P2的生物特性 外膜蛋白P2(outer membrane protein P2，P2)的分子量為36～42 kD，它是具有8個外露表面環(loops)和16個跨膜區的蛋白質;它在細胞膜的表面含量約占所有OMP含量的1/2，能夠形成三聚體，且具有膜孔蛋白的活性，允許小于1400 Da的分子通過［15］。

2.2 P2的免疫特性 P2具有很強的免疫原性，且P2可以通過與宿主體內的層粘連蛋白受體結合介導NTHi的粘附［16］。研究發現，P2在黏膜免疫中可針對大多數菌株(同源的和異源的)的表面抗原產生免疫應答，起到殺菌效果［17］。由于P2的免疫應答受到異源性的限制，因此對其保守抗原的研究十分必要。研究發現，表面暴露區域 loop6存在于所有菌株上，但loop6區域的保守性也是相對的。因此，用P2制作疫苗應克服外膜蛋白P2潛在的抗原異質性和點突變。

3 外膜蛋白P26

外膜蛋白P26(outer membrane protein P26，P26)，分子量為26 kD，天然的P26沒有熱修飾特性，它由134個氨基酸組成，攜帶一由23個氨基酸組成的N端信號序列。其N端和C端末端是疏水的，由親水性區域將其分開，序列與巴氏桿菌的伴侶蛋白(seventeen—kilodal.ton protein，Skp)有一定的同源性，而且Skp家族在腸桿菌科中具有高度的保守性。有研究顯示P26抗體與同源、異源菌株的清除有關［15］。

4 外膜蛋白P5

外膜蛋白P5(outer membrane protein P5，P5)，是分子量約為27 kD的一種熱修飾蛋白，經實驗測得的等電點為6.3～6.8，與 E.coli OmpA 同源［18］。P5可粘附于上皮細胞，是通過細胞粘附素(CEACAMs)的癌胚抗原家族尤其是CEACAM1介導的，依賴蛋白質與蛋白質之間的相互作用與CEACAMI分子結合，直接抑制機體免疫細胞活性，使得NTHi可通過跨細胞和胞吞轉運作用穿過呼吸道單層上皮細胞從而感染機體［19］。

P5蛋白外露表面環根據異源性可分為loop1、loop2、loop3、loop4四種。在關于南美栗鼠動物模型的研究中，特別是在loop3基礎上制備疫苗。由P5制備而成的疫苗在機體可產生體液免疫和細胞免疫兩種應答機制，因而P5蛋白具有免疫保護性［20］。研究表明P5在細胞膜上對陽離子存在不對稱選擇性［18］，該性質在疫苗的研制方面有望成為突破，因而P5也很有希望成為疫苗候選株。

5 外膜蛋白P4

外膜蛋白P4(outer membrane protein P4，P4)，分子量為28 000～30 000，由kZ基因編碼，是一高度特異的酸性磷酸單酯酶。它存在于所有Hi中，它在菌體獲取凝血因子Ⅹ中具有重要作用，為細菌生長所必須。

實驗研究表明，用P4免疫動物產生的抗體也具有殺菌活性。但P4是一種具有酶活性的蛋白，在人體尤其是嬰兒中使用會存在很多的問題。Hotomi等［21］指出，利用定點突變方法，通過將蛋白序列上的天冬氨酸殘基置換掉，在不影響其免疫原性的情況下，可顯著降低P4的酶活性。雖然P4對于獲取凝血因子X具有重要作用，但目前它在該過程中的具體作用尚未研究透徹。

6 其他外膜蛋白

6.1 Hia蛋白 Hia蛋白與細菌的粘附有關，是自動運輸體蛋白質家族中的一員，因其在細胞內碳末端區域并未進行加工與細胞的聯系完整，而又有別與其他的自動運輸體蛋白，能極大的增加細菌的粘附性［22］。

6.2 脂蛋白D 脂蛋白D(LPD)是分子量為42 kD的膜相關免疫球蛋白結合蛋白，位于Hi表面，和人IgD 有親和性［23，24］;其免疫原性高度保守，是 Hi的特征性毒力決定因子。

研究表明，脂蛋白D有甘油磷酸二酯酶的活性，可引起宿主上皮細胞釋放磷酰膽堿，降低上皮細胞纖毛運動的頻率，在促進黏附、吞噬及細菌侵入人單核細胞過程中表現出重要作用，但動物實驗顯示不能用LPD免疫來預防大鼠中耳炎。

6.3 HxuA蛋白 HxuA蛋白，分子量為100 kDa。所有的流感嗜血桿菌的生長均需一種含鐵化合物，血紅素，由于流感嗜血桿菌不能自身合成血紅素，故其必須從人類宿主獲取血紅素后才能生長并引起感染;流感嗜血桿菌分泌的HxuA蛋白就是用來攝取血紅素的維持自身生長的重要蛋白［15］。

7 4Sap蛋白

Sap蛋白是流感嗜血桿菌具有轉導功能的蛋白，用于亞鐵血紅素的轉導［25］。

綜上所述，流感嗜血桿菌外膜蛋白的種類很多，因其高攜帶率和致病性，目前多用于疫苗的研制，研究較為透徹的為P6，同時由于細菌的粘附性，對于其粘附機制也可進行進一步研究。

鑒于Hi的廣泛性，和外膜蛋白的多樣性，在臨床中我們可用其進行該菌的檢測以提高檢測的陽性率，或通過對外膜蛋白的清晰認識將幾種蛋白融合起來用于疫苗的制備，這樣對于流感嗜血桿菌的感染也可起到有效的防御。

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