低密度脂蛋白受體相關蛋白5對骨的影響

吳學倫，朱曉燕(綜述)，薛 鵬，李玉坤*(審校)

(1.河北醫科大學第三醫院內分泌二科，河北省骨科生物力學重點實驗室，河北 石家莊 050051；2.河北省邢臺市人民醫院腫瘤內科，河北 邢臺 054000)

低密度脂蛋白受體相關蛋白5(low density lipoprotein receptor related protein，LRP5)是低密度脂蛋白受體相關蛋白家族成員之一，表達于人類多種組織細胞，以肝臟、胰腺最多。在骨中主要表達于骨內膜和骨小梁表面的成骨細胞，尚未發現在破骨細胞表達。LRP5與果蠅生長因子Wingless共受體Arrow序列同源，它是由1 615個氨基酸組成的跨膜蛋白，由一個假定的信號肽、4個表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)樣重復序列、3個低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)重復序列跨膜區和胞內區部分組成。人LRP5進化高度保守，與小鼠LRP5的蛋白序列95 %同源[1]。

1 LRP5概述

LRP5功能缺失突變會導致骨質疏松癥假神經膠質瘤(osteoporosis pseudoglioma syndrome，OPPG)，OPPG是一種骨形成嚴重減少和胚胎期視血管持續形成進而導致低骨量和失明的罕見疾病[2]。另外，LRP5功能獲得突變會導致一種高骨量綜合征(high bone mass syndrome，HBM)，HBM具有非常高的骨量，耐高沖擊性骨折(比如車禍)，并且游泳時不能浮在水面上[3]。同種基因的不同突變導致兩種性質相反的骨骼疾病，表明LRP5通路對骨形成及骨量至關重要。

LRP5通過成骨細胞Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)信號通路調節骨量。LRP5(和同源LRP6)與卷曲蛋白(frizzled)一起作為Wnt蛋白的共受體。Wnt與LRP5-frizzled共受體結合使糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase，GSK-3β)失活，導致β-catenin的胞質積累，隨后β-catenin轉移至細胞核影響基因轉錄。實驗[4]表明，LRP5為成骨細胞Wnt信號和β-catenin激活所必需，其基因突變阻礙了LRP5內化及與其他配體Dkk1等的結合。LRP5與Arrow序列同源，Wnt蛋白啟動的LRP5和Axin交互細胞實驗同樣表明，LRP5是Wnt蛋白的一個共受體。因此，OPPG和HBM被視為Wnt相關疾病。

然而，某些實驗研究的結果與這一觀點相矛盾。第一，與大多數Wnt蛋白功能發展形成鮮明對比的是，LRP5功能缺失突變(LRP5-/-)胚胎并沒有明顯的骨骼缺損；第二，功能獲得性LRP5基因突變不會引起骨腫瘤，Wnt信號通路在其他器官的活化則可能會導致骨腫瘤的發生[5]；第三，成骨細胞經典Wnt信號通路的分子節點β-catenin的特定缺失和功能獲得突變，既不影響骨形成，也不影響LRP5特異性失活所引發的失控基因的表達[6]。這些研究結果表明，LRP5和經典Wnt信號通路通過不同機制調節成骨細胞的功能。

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是產生于腦干神經元和腸嗜鉻細胞的一種活性胺，不能通過血腦屏障。因此，由于其合成的部位不同，它實際上具有2種功能特性，大腦產生的5-HT參與人的認知功能；而占總數95%的腸道5-HT，即腸源性血清素(gut derived serotonin，GDS)的功能，目前尚存爭議。GDS生物合成途徑與限速酶色氨酸羥化酶1(tryptophan hydroxylase 1，Tph1)有關。GDS釋放、彌散于血液中，大多數通過特定運輸途徑被血小板攝取、儲存，另外在血清中游離的一小部分，與靶細胞的5-HT受體(5-hydroxytryptamine receptor，HTR)結合發揮作用。值得注意的是，長期服用5-HT再攝取抑制劑(serotonin specific reuptake inhibitor，SSRIs)的患者，其細胞外5-HT的濃度增加，而骨量減少[7]。另外，在尋找解釋LRP5調節骨形成的分子機制過程中，Yadav等[8]確定Tph1是LRP5-/-模型中骨組織過度表達程度最高的基因；Tph1在敲除LRP5的十二指腸細胞中表達也會增加。抑制LRP5-/-小鼠的5-HT合成能糾正其骨表型，腸道特定敲除LRP5 能復制LRP5-/-小鼠的骨表型，但在成骨細胞敲除則不能。5-HT結合到HTR1B受體，通過調節CyclinD1分子的表達，影響成骨細胞增殖，最終決定骨形成的程度。

2 LRP5突變導致的骨骼疾病

LRP5突變主要導致2種骨骼疾病的發生：一種是常染色體隱性遺傳疾病——OPPG，以出生早期出現的視力損害及骨脆性增加為特點；另一種是常染色體顯性遺傳疾病——HBM，主要影響長骨和顱骨的皮質骨。這兩種疾病的分子決定因素都映射到11號染色體相同的區域，后來被證實為LRP5編碼區。

OPPG患者的LRP5基因突變，導致LRP5功能缺失和Wnt信號活動減少，進而導致成骨細胞活動減少，這與在小鼠模型中特定破壞LRP5的骨骼表型相一致[9]。HBM表型患者雜合LRP突變的分子特點表明，此突變發生于LRP5結構中一個進化高度保守的區域，形成一個β螺旋結構，通過此結構，LRP5與Dkk1相互作用。體外試驗進一步證明，在LRP5錯義突變情況下，Dkk1對Wnt信號的正常抑制發生缺陷，從而導致Wnt信號和成骨細胞活動增加，這一結論在LRP5突變小鼠的成骨細胞系細胞中得以證實[10]。后續7個不同的LRP5基因突變的分子特性呈現出一種明顯的HBM，表明LRP5突變蛋白減少了與Dkk1的交互作用且受Dkk1的抑制程度降低。

與上述發現相一致，最近的研究也表明，在骨細胞中含有特定OPPG錯義突變的LRP5表達的小鼠，會導致骨量丟失；在晚期成骨細胞和骨細胞中含有特定HBM錯義突變的LRP5表達的小鼠，會導致骨量增加。另外，LRP5 似乎作用于其局部微環境，因為LRP5的HBM形式特定限制在外周骨，導致外周骨量的增加，對中樞骨量沒有影響[11]。總之，同一基因LRP5的突變導致本質完全相反的骨疾病(低或高骨質)，均能表明LRP5在骨形成中的重要作用。

3 LRP5對骨的直接作用

2個不同研究機構已經觀察到LRP5獲得性突變對骨骼的直接影響。Yadav等[12]把G171V敲進cDNA的LRP5基因突變編碼區域，其模型優勢在于有一個環狀5′-端的cDNA終止序列，以致G171V等位基因的表達能在特定組織通過cre介導重組被激活。Babij等[13]使用3.6kol鼠Ⅰ型膠原蛋白啟動子在小鼠成骨細胞過表達人類LRP5-G171V功能突變。這種轉基因小鼠成骨細胞呈現HBM表型。此外，成骨細胞的野生型受體的過度表達也會增加骨量，然而與G171V誘導成骨細胞的過表達程度不同。這些觀察盡管與Yadav等[12]研究結果不同，但都表明LRP5有直接的骨骼效應。鑒于動物模型之間的差異，LRP5及其功能獲得性突變可能只在過量時存在直接的骨骼效應，而不是在生理水平。另外，兩者的差異可能源于不同系種、不同階段成骨細胞啟動子的利用。成骨細胞譜系LRP5信號通路有可能在的早期階段是必需的，而Yadav等[8]在LRP5對早期骨骼施加直接影響后，才開始驅動成骨細胞LRP5突變。

LRP5-/-小鼠原代成骨細胞機械負荷反應改變表明，LRP5對骨骼存在直接作用[14]。機械負荷和其他刺激可能產生一個局部環境刺激LRP5直接骨骼效應。

研究表明LRP5是一個真正的Wnt受體。然而，是否經典Wnt信號途徑足夠解釋LRP5突變對骨量的影響？盡管LRP5缺失的純合子小鼠(具有與OPPG患者相似的特點)出生后骨量低源于成骨細胞數量和活動較少，而早期或晚期成骨或骨細胞β-catenin缺失小鼠的骨量減少，主要是由于骨吸收增加而不是骨形成減少。而且，骨Wnt針對性去除引起的骨吸收增加，至少部分是由于破骨細胞分化因子配體(nuclear factor-κB ligand，RANKL)的激活和骨分化抑制劑骨保護素(osteoprotegerin，OPG)表達的減少[6, 15]。有趣的是，應該注意成骨細胞/骨細胞β-catenin缺失小鼠骨吸收增加和骨量減少，與包含一個自發的低密度脂蛋白受體相關蛋白6(low density lipoprotein receptor related protein，LRP6)次等位基因突變小鼠骨表型非常類似。因此，LRP5和LRP6是否以同樣的方式調節Wnt信號？LRP5在成骨細胞內作用是否增強成骨細胞活動和骨形成？LRP6在成骨細胞內作用是否限制破骨細胞的功能？上述問題仍有待進一步研究[16-17]。

4 LRP5對骨的間接作用

LRP5-/-小鼠骨細胞增殖相關基因表達下降。據報道，LRP5-/-小鼠成骨細胞缺乏，而從LRP5-/-小鼠分離的成骨細胞體外增殖正常，所以可能是成骨細胞外信號導致了LRP5-/-成骨細胞增殖的減少。Tph1是在LRP5-/-骨中表達差異最大的基因，而且LRP5-/-小鼠在十二指腸也有Tph1表達并隨5-HT水平升高。高水平5-HT抑制LRP5-/-和野生型小鼠體外成骨細胞的增殖，而LRP5-/-小鼠低色氨酸飲食或給予5-HT的合成抑制劑后表現出5-HT濃度降低和骨骼表型的正常。這些結果初步證明高水平的5-HT抑制LRP5-/-小鼠骨形成，導致其骨量下降[18]。

為研究LRP5、5-HT與骨之間聯系，從而培育出腸道或成骨細胞特定LRP5功能缺失或增強性轉基因小鼠。腸道LRP5特定剔除，呈現出5-HT高循環水平與LRP5-/-小鼠骨骼表型，成骨細胞特定剔除則沒有出現上述結果。相反，通過插入編碼HBM突變的LRP5-G171V cDNA使腸道LRP5過表達，5-HT濃度降低并產生高骨表型，成骨細胞特定表達則沒有出現上述結果。上述研究結果證實，LRP5通過影響腸道間接調節骨形成。確定5-HT作為腸道LRP5和骨骼的介質后，腸道特定刪除Tph1降低5-HT循環水平并產生高骨質量表型，而成骨細胞Tph1特定刪除則沒有[4]。

升高的5-HT作為一種激素，作用于成骨細胞抑制骨形成。成骨細胞膜表面表達3種5-HT受體：HTR1B、HTR2A和HTR2B。小鼠全部HTR2A基因刪除或成骨細胞特定HTR2B刪除，并不顯示骨骼表型；然而，小鼠成骨細胞特定刪除或全身至少HTR1B基因的一個等位基因的剔除，顯示與腸道HBM LRP5-G171V基因突變小鼠類似的HBM表型。這表明HT1B調節5-HT受體介導的成骨細胞效應。體外研究證實，來自HTR2A和HTR2B缺失突變小鼠的原代成骨細胞對5-HT的應答，與野生動物的成骨細胞類似，而HTR1B缺失突變小鼠成骨細胞對5-HT特定介質反應遲鈍。隨后研究顯示，5-HT信號通路轉錄因子是成骨細胞cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)，能夠雙向調節基因轉錄。5-HT結合HTR1B，抑制CREB表達，進而抑制D型細胞周期蛋 白1(cyclin D1，CycD1)表達和成骨細胞增殖[19]。

Yadav等[8]研究表明，LRP5通過調節5-HT的水平，從而影響骨代謝，上述過程主要發生在十二指腸，而不是骨內；Cui等[11]研究表明，在腸干細胞(產生5-HT的腸嗜鉻細胞的干細胞)，兩種截然不同的HBM LRP5突變，并沒有產生HBM表型；缺失LRP5純合子小鼠在這些腸干細胞沒有顯型表達；HBM LRP5等位基因表達的小鼠與野生型小鼠的5-HT循環水平未發現明顯差異。同時發現，HBM骨密度增加，敲除骨細胞的LRP5會導致骨量減少；四肢骨細胞中LRP5基因突變表達會造成骨量改變，椎骨則沒有。降低循環和腸內5-HT水平，并不影響皮質或骨小梁質量；也不影響骨形成的生化標記物[20]。

基于上述爭議，Korvala等[21]利用體外細胞培養進一步研究LRP5新發突變在LRP5產生、Wnt信號通路和Tph1及HTR1B基因表達中的效應。18個無成骨不全(Osteogenesis imperfecta，OI)特性的原發性兒童骨質疏松癥患者，LRP5兩個新發突變(c.3446T>A；p.L1149Q和c.3553G>A；p.G1185R)被確定存在于2個患者和其家族成員中。體外分析表明，新突變與之前報道的突變(p.C913fs，p.R1036Q)顯著降低經典Wnt信號通路活動。結果導致骨形成減少，骨表型變化。腸源性LRP5曾被證實可通過調節Tph1的表達，進而調節5-HT的合成。而此研究表明，LRP5突變沒有影響Tph1表達，只有一種突變(p.L1149Q)降低了HTR1B的表達。同時Boudin等[22]評估HTR1B和Tph1在顱骨肥大(一組單基因硬化性骨病)發展中的作用。他們對53例缺乏已知致病基因LRP5，LRP4和SOST突變的2個基因編碼區進行篩選，并沒有發現致病變異編碼區。因此，尚不能證明Tph1和HTR1B在測試患者人群中對硬化性骨病的重要影響。

5 小 結

為什么不同研究機構的研究結果差異如此之大，目前還不清楚。可能歸因于Cre重組酶在小鼠啟動子定位的差異，以及基因結構、小鼠模型、測量骨密度的方法、骨測試的方法、小鼠的生長環境和5-HT測定技術的不同等。LRP5究竟如何調節骨量？是直接調節成骨細胞譜系細胞，還是通過內分泌或旁分泌信號間接調節？有待進一步深入研究。

[1] HEY PJ,TWELLS RC,PHILLIPS MS,et al.Cloning of a novel member of the low-density lipoprotein receptor family[J].Gene,1998,216(1):103-111.

[2] BURGERS TA,WILLIAMS BO.Regulation of Wnt/beta-catenin signaling within and from osteocytes[J].Bone,2013,54(2):244-249.

[3] GONG Y,SLEE RB,FUKAI N,et al.LDL receptor-related protein 5 (LRP5) affects bone accrual and eye development[J].Cell,2001,107(4):513-523.

[4] MAEDA K,TAKAHASHI N,KOBAYASHI Y.Roles of Wnt signals in bone resorption during physiological and pathological states[J].J Mol Med (Berl),2013,91(1):15-23.

[5] MOON RT,KOHN AD,DE FERRARI GV,et al.WNT and beta-catenin signalling: diseases and therapies[J].Nat Rev Genet,2004,5(9):691-701.

[6] GLASS DA 2ND,BIALEK P,AHN JD,et al.Canonical Wnt signaling in differentiated osteoblasts controls osteoclast differentiation[J].Dev Cell,2005,8(5):751-764.

[7] DUCY P,KARSENTY G.The two faces of serotonin in bone biology[J].J Cell Biol,2010,191(1):7-13.

[8] YADAV VK,ARANTES HP,BARROS ER,et al.Genetic analysis of Lrp5 function in osteoblast progenitors[J].Calcif Tissue Int,2010,86(5):382-388.

[9] BOYDEN LM,MAO J,BELSKY J,et al.High bone density due to a mutation in LDL-receptor-related protein 5[J].N Engl J Med,2002,346(20):1513-1521.

[10] ZUO C,HUANG Y,BAJIS R,et al.Osteoblastogenesis regulation signals in bone remodeling[J].Osteoporos Int,2012,23(6):1653-1663.

[11] CUI Y,NIZIOLEK PJ,MACDONALD BT,et al.Lrp5 functions in bone to regulate bone mass[J].Nat Med,2011,17(6):684-691.

[12] YADAV VK,RYU JH,SUDA N,et al.Lrp5 controls bone formation by inhibiting serotonin synthesis in the duodenum[J].Cell,2008,135(5):825-837.

[13] BABIJ P,ZHAO W,SMALL C,et al.High bone mass in mice expressing a mutant LRP5 gene[J].J Bone Miner Res,2003,18(6):960-974.

[14] WARDEN SJ,ROBLING AG,SANDERS MS,et al.Inhibition of the serotonin (5-hydroxytryptamine) transporter reduces bone accrual during growth[J].Endocrinology,2005,146(2):685-693.

[15] HOLMEN SL,ZYLSTRA CR,MUKHERJEE A,et al.Essential role of beta-catenin in postnatal bone acquisition[J].J Biol Chem,2005,280(22):21162-21168.

[16] JOINER DM,KE J,ZHONG Z,et al.LRP5 and LRP6 in development and disease[J].Trends Endocrinol Metab,2013,24(1):31-39.

[17] GOLTZMAN D.LRP5,serotonin,and bone: complexity,contradictions,and conundrums[J].J Bone Miner Res,2011,26(9):1997-2001.

[18] WARDEN SJ,ROBLING AG,HANEY EM,et al.The emerging role of serotonin (5-hydroxytryptamine) in the skeleton and its mediation of the skeletal effects of low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (LRP5)[J].Bone,2010,46(1):4-12.

[19] MONROE DG,MCGEE-LAWRENCE ME,OURSLER MJ,et al.Update on Wnt signaling in bone cell biology and bone disease[J].Gene,2012,492(1):1-18.

[20] ZHANG W,DRAKE MT.Potential role for therapies targeting DKK1,LRP5,and serotonin in the treatment of osteoporosis[J].Curr Osteoporos Rep,2012,10(1):93-100.

[21] KORVALA J,JUPPNER H,MAKITIE O,et al.Mutations in LRP5 cause primary osteoporosis without features of OI by reducing Wnt signaling activity[J].BMC Med Genet,2012,13:26.

[22] BOUDIN E,JENNES K,DE FREITAS F,et al.No mutations in the serotonin related TPH1 and HTR1B genes in patients with monogenic sclerosing bone disorders[J].Bone,2013,55(1):52-56.