PA感染與定植中血液PEA變化的研究

傅玉瓊 周 偉 熊 彬 湛曉勤*

（四川省瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 瀘州 646000）

PA感染與定植中血液PEA變化的研究

傅玉瓊 周 偉 熊 彬 湛曉勤*

（四川省瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 瀘州 646000）

目的 探討銅綠假單胞菌外毒素（PEA）在銅綠假單胞菌肺部感染及定植表達(dá)差異的臨床價(jià)值。方法 SD大鼠180只，隨機(jī)分為PA（銅綠假單胞菌）感染模型組，PA咽部定植組及生理鹽水對(duì)照組。觀(guān)察PA感染與定植中血液PEA變化。結(jié)果 肺組織結(jié)構(gòu)正常，定植組與對(duì)照組無(wú)明顯區(qū)別，模型組出現(xiàn)了明顯肺泡及肺間質(zhì)水腫、出血、炎性細(xì)胞聚集的炎癥表現(xiàn)。模型組血液PEA DNA表達(dá)在接種后第3、7、11天均明顯高于定植組，二者比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。結(jié)論 血清檢測(cè)有助于對(duì)銅綠假單胞菌感染與定植的鑒別診斷，且可預(yù)測(cè)肺部炎癥的程度及預(yù)后。

銅綠假單胞菌外毒素；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；感染；定植

銅綠假單胞菌外毒素A（P aeruginosa ExotoxinA，PEA）是銅綠假單胞菌的主要致病物質(zhì)，通過(guò)抑制細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，95 %以上臨床分離PA都會(huì)分泌這種毒素[1]，其基因高度保守[2]，鑒于PEA具有高表達(dá)及高度保守性，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制作大鼠肺部感染及咽部定植模型并檢測(cè)血液中PEA表達(dá)量的差異，為臨床上銅綠假單胞菌的感染和定植的鑒別提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠180只，體質(zhì)量200～250 g。

1.1.2 PA菌株：由本學(xué)院檢驗(yàn)科提供分離出的標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌株，用分光光度比色法配成2個(gè)麥?zhǔn)蠁挝粷舛?（6×108cFu/mL）。

1.1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成參照GenBank公布的序列：上游引物：5CGAACCTTGGCAGTCTCCTA3：下游引物：5CCGGACCA CTTACACCGATC3。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立：所有動(dòng)物均事先應(yīng)用地塞米松抑制免疫3 mg/（kg·d），皮下注射，每日1次，連用7 d。將180只SD大鼠隨機(jī)分為三組（每組各60只），即模型組：從氣管內(nèi)注入0.4 mL銅綠假單胞菌混懸液（2個(gè)麥?zhǔn)蠁挝粷舛?6×108CFU/mL）；對(duì)照組：從氣管內(nèi)注入0.4 mL生理鹽水；定植組：從鼻腔、咽部滴入相同的菌液濃度0.2 mL。

1.2.2 取材

分別于接種后第3、7、11天取材，經(jīng)腹腔注射2 %苯巴比妥（30 mg/kg）麻醉后，心臟采血方法處死，無(wú)菌取出肺組織。

1.2.3 組織病理學(xué)檢查：取出右側(cè)肺組織，10 %福爾馬林溶液固定，石蠟包埋、切片HE染色，光學(xué)下觀(guān)察。

1.2.4 肺細(xì)菌學(xué)檢查：將左側(cè)肺組織勻漿行培養(yǎng)，取0.1 mL稀釋并涂盤(pán)培養(yǎng)，計(jì)數(shù)菌落。

1.2.5 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)：①提取左側(cè)肺組織勻漿DNA；②FQ2 PCR反應(yīng)體系定量檢測(cè)DNA。

1.2.6 使用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用重復(fù)測(cè)量方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果：模型組在接種后第3、7天PA菌落數(shù)均＞106cfu/mL，第11天＞104cfu/mL；定植組咽拭子在第3、7天培養(yǎng)均能見(jiàn)大量PA生長(zhǎng)，第11天細(xì)菌數(shù)量較前有所減少；定植組及對(duì)照組肺組織未見(jiàn)PA菌生長(zhǎng)。2.2 肺組織病理學(xué)：光鏡下，對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)正常，定植組與對(duì)照組無(wú)明顯區(qū)別，未見(jiàn)明顯的肺泡間隔水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有明顯病理改變，在接種后第3天都出現(xiàn)了明顯肺泡及肺間質(zhì)水腫、出血、炎性細(xì)胞聚集的炎癥表現(xiàn)；第7天炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有所減少，肺泡水腫減輕；第11天炎性細(xì)胞較前明顯減少，淋巴細(xì)胞出現(xiàn)，肺泡腔擴(kuò)大，間隔增寬。

2.3 FQ-PCR目的片段擴(kuò)增

2.3.1 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1所示，可以觀(guān)察到位于200 bp與150 bp間有一特征條帶，無(wú)其他非特異性擴(kuò)增的條帶。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：梯度稀釋DNA模板，在Rotor-Gene 3000上進(jìn)行SYBR Green I熒光定量PCR，軟件自動(dòng)生成擴(kuò)增曲線(xiàn)（如圖2）和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。由構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可見(jiàn)，起始模板濃度與CT值間有良好的線(xiàn)性關(guān)系（R2分別為0.9992、0.9989）。

圖1 PEA基因片段pcr擴(kuò)增

圖2 PEA擴(kuò)增曲線(xiàn)

3 討 論

由于本實(shí)驗(yàn)中使用免疫抑制劑，使進(jìn)入肺內(nèi)的細(xì)菌不斷繁殖及毒素產(chǎn)生，引起組織破壞嚴(yán)重。接種后第3天細(xì)菌數(shù)量多、毒力強(qiáng)，機(jī)體免疫功能低下，以多核白細(xì)胞浸潤(rùn)為主。多核白細(xì)胞是PA肺部感染早期主要的炎性細(xì)胞，其在清除病原體的同時(shí)也導(dǎo)致肺損傷。同時(shí)肺部PA感染時(shí)，能誘導(dǎo)體內(nèi)炎性細(xì)胞因子表達(dá)增加，引起趨化肽釋放，細(xì)胞因子有相互促進(jìn)的作用，升高的細(xì)胞因子又加重肺組織損傷，還可使內(nèi)皮細(xì)胞活化而導(dǎo)致血管通透性增加，肺泡腔內(nèi)炎性滲出增加，使炎性反應(yīng)鏈增強(qiáng)，細(xì)菌及毒素入血增加進(jìn)一步刺激細(xì)胞因子分泌，加重肺部炎癥。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，被抑制的免疫逐漸恢復(fù)，PA在體內(nèi)被吞噬細(xì)胞清除，使存留在肺內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量減少，肺部炎癥減輕同時(shí)炎性細(xì)胞因子釋放減少，肺部損傷減輕，故在感染后第7天PEA DNA的表達(dá)量較第3天降低，第11天最低。因而我們可以檢測(cè)PEA DNA的水平，依靠這種差異有助于銅綠假單胞菌感染與定植的鑒別。由此我們通過(guò)檢測(cè)PEA DNA表達(dá)量的不同可以將感染與定植區(qū)分開(kāi)，為臨床鑒別診斷PA感染及定植提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] 佟 偉,吳囡,李會(huì).銅綠假單 胞菌外毒 素A原核表 達(dá)載體 的 構(gòu)建 及鑒定[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2008,35(12):2317-2318.

[2] 郭生玉,李勝岐.銅綠假單 胞菌感染豚鼠后生物 被 膜形成的研 究[J].中華微生物和免疫學(xué)雜志,2003,23(4):292-295.

Study on PEA in the Blood in Detection and Differential Diagnosis of PA Infection and Colonization

FU Yu-qiong, ZHOU Wei, XIONG Bin, ZHAN Xiao-qin*
(Department of Respiratory Medicine, The Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, China)

Objective To investigate the pseudomonas aeruginosa exotoxin (PEA) in pseudomonas aeruginosa lung infection, and the clinical value of engraftment expression differences. Methods 180 SD rats, were randomly divided into PA(pseudomonas aeruginosa) infection model group, PA pharyngeal engraftment group and normal saline control group. Observation of PA infection and engraftment of PEA changes of blood. Results The structure of normal lung tissue, engraftment group and the control group, no significant difference between model group and there is an obvious alveolar pulmonary interstitial edema, hemorrhage and inflammatory cell aggregation of inflammation. Model group blood PEA DNA expression in 3, 7, 11 days after inoculation were significantly higher than that of engraftment group, which shows there is statistical significance(P＜0.01). Conclusion Serum helps to pseudomonas aeruginosa infection and engraftment, the differential diagnosis of the degree and the prognosis of lung inflammation and predictable.

Pseudomonas aeruginosa exotoxin; Real-time fluorescent quantitative PCR; Infection; Engraftment

R563.1

：B

：1671-8194（2014）01-0010-02

*通訊作者:E-mail: 490546615@qq.com