兔股骨頭壞死模型的血管內皮生長因子和Bcl-2的表達

何志明

(佛山市三水區人民醫院，廣東 佛山 528100)

兔股骨頭壞死模型的血管內皮生長因子和Bcl-2的表達

何志明

(佛山市三水區人民醫院，廣東 佛山 528100)

目的 建立可靠的激素性股骨頭壞死的家兔模型，探討股骨頭壞死中血管內皮因子與和抑制凋亡基因（Bcl-2）的表達。方法 選取健康的雄性新西蘭大白兔30只，隨機分成模型組15只和對照組15只，模型組用靜脈注射脂多糖加肌內注射地塞米松造成股骨頭壞死，對照組注射同等劑量的生理鹽水，在造模第4、8和12周時，處死動物模型，通過對壞死股骨頭的組織病理學及免疫組化技術觀察血管內皮生長因子和Bcl-2的表達。結果 隨著造模時間段的推移，股骨頭內的血管內皮生長因子和Bcl-2基因在各個組的表達量逐漸降低，與對照組的差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論 在聯合應用地塞米松和脂多糖所構建的股骨頭壞死動物模型中，股骨頭內的血管內皮生長因子和Bcl-2基因表達均受到抑制。

股骨頭壞死；血管內皮生長因子；Bcl-2

激素性股骨頭壞死是臨床上常見的疾病，多數發生在青壯年，如果不采取合適的治療措施，患者會出現股骨頭塌陷以及髖關節功能障礙[1]，嚴重影響到患者的生活質量。構建理想的股骨頭壞死的動物實驗模型，是+探究股骨頭壞死的病因和發病機制的一種必要手段，也是開展股骨頭壞死治療的一項研究基礎。在總結以往成功經驗的基礎上建立一個更加接近人早期股骨頭壞死的動物模型，使用大劑量的地塞米松聯合小劑量脂多糖誘導兔的股骨頭壞死[2]，進而通過組織病理學及免疫組化技術探討不同的時間段Bcl-2基因表達和血管內皮生長因子的動態改變。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取30只雄性的新西蘭大白兔，平均體質量2.5～3.5 kg，隨機分組，模型組15只，對照組15組。模型組處理方法為連續2 d耳緣靜脈注射脂多糖，注射劑量為每日10 μg/kg。然后持續3 d每日按照25 mg/kg的劑量肌內注射地塞米松，對照組則注射相同劑量生理鹽水。所有模型給予相同食物飼養。在構建模型的第4、8和12周時，采用空氣栓塞方法處死模型后，立刻取下兩側的股骨頭，一側儲存在液氮罐中用來熒光PCR的檢測，另一側剖開，置于4 %福爾馬林中保存。

1.2 組織形態學觀察

取出保存的一塊股骨頭標本用5 %硝酸脫鈣處理后，石蠟包埋，HE染色[3]。利用光學顯微鏡觀察股骨頭形態學改變，然后任選3個高倍視野下取一半的攝片視野測出空骨陷窩所占到的百分比。

1.3 熒光定量PCR檢測

每時間點處死動物，取出保存好的股骨頭，將其置入無菌的研缽研成粉末狀，然后置于離心管立刻加入Trizol試劑，按Trizol方法提取模型股骨頭的總RNA，緊接著進行純化和反轉錄。所選用的引物如下：VEGF所需引物：5'-GTGGACATCTTCCAGGAGTACC-3'；5' -GATCCGCATGATCTGCATGGTG-3'。Bcl-2所需引物：5'-GCTACGA GTGGGATACTGGAG-3'；5'-ACGGTAGCGACGAGAGAAGT-3'。

檢測方法：加入cDNA（250 ng/μL）模板2 μL，SYBR Green熒光染料10 μL，雙蒸水7 μL，引物各0.5 μL，每個反應體系20 μL，加入PCR儀定量的專用毛細管中，放入儀器，進行相應的PCR反應，不同的溫度下檢測熒光，一共40個循環。

1.4 統計方法

采用SPSS 13.0軟件統計分析，資料全部用均數±標準差表示，比較采用t和χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計意義。

2 結 果

2.1 組織形態學觀察

肉眼下觀察到模型組股骨頭剖面呈淺紅色，對照組的剖面呈現紅色。光學顯微鏡下看到模型組相比對照組軟骨下骨板較薄，骨小梁變細而且稀疏，骨小梁中看到細胞核變形，骨細胞很少見到，空骨陷窩比對照組明顯增多，髓腔內脂肪細胞增大、增多。兩側股骨頭軟骨下區骨凹陷空虛率為：模型組為（28.04±1.68） %，對照組為（10.85± 1.28） %，兩組差異比較具有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 定量熒光PCR結果

模型組在構建模型的第4、8和12周時，模型股骨頭中Bcl-2 mRNA的表達量和血管內皮生長因子很明顯的低于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1和表2。

表1 模型組和對照組血管內皮生長因子mRNA表達量

表2 模型組和對照組Bcl-2 mRNA的表達量

3 討 論

股骨頭壞死可以分為創傷性和非創傷性兩種，但是二者都有一個相似的病理變化——缺血以及缺血以后細胞死亡和修復反應[4]，股骨頭壞死大多數是從死骨的邊界和四周有活性的組織結合部位開始修復，主要表現在血管再生、新骨生成和死骨的吸收。然而隨著死骨修復向中央發展，死骨的吸收程度加強，明顯的減弱的是新骨生成與血管修復。血管內皮生長因子主要能夠特異性地對血管生成的前一個階段起到相應作用，能夠促使血管內皮細胞的增殖和血管的形成[5]。血管內皮生長因子是在牛的垂體中濾泡星形細胞的體外培養液里分離出來由Ferrara等學者于1989年發現的，血管內皮生長因子主要的生物學功能為誘導血管生成，具有強烈的內皮細胞促進有絲分裂作用，還具有改變血管內皮的某些基因的表達、增加血管通透性以及促使組織因子從血管內皮分泌等作用。Suzuki等[6]也已經闡明血管內皮生長因子具有促進股骨頭壞死局部的區域中的新血管生成。細胞凋亡也可發生于激素性股骨頭壞死，Bcl-2通過阻斷細胞凋亡信號傳遞從而抑制細胞凋亡。

通過對壞死股骨頭的組織病理學及免疫組化技術觀察，在聯合應用地塞米松和脂多糖所構建的股骨頭壞死動物模型中，股骨頭內的血管內皮生長因子和Bcl-2基因表達均受抑制。

[1] Drescher W,Schneider T,Becker C,et al.Reperfusion pattern ofthe immature femoral head after critical ischemia:a microspherestudy in pig[J].Acta Orthop Scand,1999:70(5):439-445.

[2] 孔令擘,牛舜,楊重非,等.兔股骨頭缺血壞死模型的建立研究及比較[J].第四軍醫大學學報,2009,30(2):138-140.

[3] Alter J.Nontraumatic vascular necrosis of the femoral head:past, present and future[J].Clin Orthop,1992(277):12-21.

[4] 趙忠岳,李世民,婁思權,等.關節外科學[M].天津:天津科學技術出版社,2002:1021-1023.

[5] Ferrara N.Vascular endothelial growth factor:basic science andclinical progress[J].Endocr Rev,2004,25(4):581-611.

[6] Suzuki O,Bishop AT,Sunagawa T.VEGF promoted surgicalangiogenesis in necrotic bone[J].Micmsurgery,2004,24(1):85-91.

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：1671-8194（2014）02-0045-02