Tr1細胞免疫調控與移植物抗宿主病的研究進展＊

尹靈梅，陳 黎綜述，張 鈾△審校

（1.昆明醫科大學第二附屬醫院血液科，昆明650101；2.武警云南總醫院門診部，昆明650203）

具有免疫抑制功能的調節性T細胞在機體對內源性及外源性抗原的免疫耐受中發揮著重要的作用。調節性T細胞在機體由于免疫系統功能紊亂所致的疾病中發揮有重要作用。機體有很多種類的調節性T細胞亞型，主要包括自然發生的調節性T細胞和誘導型調節性T細胞。其中1型調節性T細胞（type 1regulatory T cell，Tr1）是由初始CD4＋T細胞分化而來的誘導型調節性T細胞，其特點是能夠生成大量具有免疫抑制功能的IL－10，轉化生長因子（TGF）－β。Tr1細胞對維持外周免疫耐受，抑制自身免疫反應和異常免疫細胞介導的免疫病理損傷有重要作用。同時還能抑制移植排斥反應和移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）。鑒于Tr1細胞的免疫調節功能，經體外擴增得到的人類Tr1細胞對人類疾病治療現已進入臨床試驗階段。本文主要對Tr1細胞的生物學特征，以及在GVHD的臨床應用潛能作一綜述。

1 Tr1細胞概述

機體免疫系統的功能包括免疫防御、免疫自穩、免疫監視。免疫功能紊亂將會導致機體發生超敏反應／免疫缺陷病，自身免疫病，腫瘤，慢性感染。免疫系統功能的有效發揮有賴于機體的免疫調控系統，特別是負調控作用，其中具有免疫抑制功能的調節性T細胞對調節機體免疫應答有重要作用。現在經研究闡明的調節性T細胞亞型主要包括CD4＋CD25＋Foxp3＋T細胞［1］以及分泌IL－10的 Tr1［2］，CD4＋Th3，CD4－CD8－T細胞［2］。Tr1細胞是一類誘導型的調節性T細胞，在體內或體外某些條件下可以誘導初始CD4＋T細胞向Tr1細胞分化［3－4］。這類細胞的特點是能分泌大量具有免疫抑制效應的IL－10、TGF－β，無IL－4的分泌［3］（IL－4是IgE生成的正調節因子，IgE是參與Ⅰ型超敏反應的主要抗體），無Foxp3基因的表達［5］。它對調節機體免疫應答以及誘導外周免疫耐受具有重要作用。Tr1細胞最早是在接受了同種異體造血干細胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）并產生長期移植耐受的重癥聯合免疫缺陷（severe combined immunodeficient，SCID）患者體內發現的。現在也有研究發現，在接受人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）相合的 HSCT的β－地中海貧血的患者體內也有Tr1細胞的存在，并且與患者移植后誘導移植嵌合形成有關［6］。

2 Tr1細胞特征及其生物學效應

人類Tr1細胞最早是在成功接受HLA不相合HSCT并且產生了長期免疫耐受的SCID患者體內發現的，將這些患者外周血同種異體反應性CD4＋T細胞進行體外培養，發現這些CD4＋T細胞可以產生大量的IL－10，而無IL－4和IL－2的生成，這類CD4＋T細胞及其效應分子還與受者在不需接受免疫抑制治療也可建立移植耐受且不發生GVHD相關［7］。將人或鼠CD4＋T細胞在體外條件下與大劑量IL－10共培養，該培養條件下誘導分化得到的T細胞亞類其效應分子的生成與Th1和Th2細胞不同，但與成功接受HLA不相合HSCT并且產生了長期免疫耐受的SCID患者體內發現的同種異體反應性T細胞分泌的效應分子相同。這類T細胞克隆能夠分泌大量的IL－10、TGF－β，少量的γ干擾素、IL－2，無IL－4的生成，而且這類細胞能夠通過分泌IL－10、TGF－β抑制同種異體反應性T細胞的活化。

Tr1細胞功能的發揮有賴于特異性的抗原作用于細胞表面受體后活化增殖分化，Tr1細胞一旦活化后其免疫調節作用是無特異性的［3－4］。活化后的Tr1細胞其增殖能力有限，可表達活化相關的細胞表面標志如：CD25、CD40L、CD69、HLA－DR以及CD152［8］。Tr1細胞發揮免疫抑制功能主要與其生成具有免疫抑制功能的效應分子IL－10、TGF－β相關［4，9］。IL－10是一種具有強大免疫抑制功能的細胞因子，它被認為是控制炎性反應，抑制免疫效應細胞的功能以及維持免疫耐受的重要調節因子。IL－10主要作用于抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）［9］，通過抑制主要組織相容性復合體Ⅱ（major histocompatability complex－Ⅱ，MHC－Ⅱ），共刺激分子以及促炎細胞因子和趨化因子的表達抑制APC的功能。IL－10也可以直接抑制T細胞的功能及效應分子的產生。Tr1細胞除了通過生成具有免疫抑制效應的細胞因子發揮其免疫調控作用外還可通過與靶細胞的直接接觸發揮效應，Tr1細胞通過生成穿孔素B和顆粒酶對效應細胞發揮直接殺傷作用。在體外經CD3，CD46單克隆抗體誘導初始CD4＋T細胞分化生成的產生IL－10的T細胞亞類能夠生成穿孔素B［10］。Tr1細胞分泌穿孔素和顆粒酶裂解APC需要Tr1細胞識別APC表面的HLA－Ⅰ類分子，細胞表面黏附分子LFA－Ⅰ介導的Tr1細胞與APC的免疫黏附，以及Tr1細胞表面CD2、CD266的活化［10］。

很多研究期望能夠發現Tr1細胞的特異性標記，從而將Tr1細胞與其他類型的調節性T細胞相區分。Cobbold等［11］比較了鼠和人的Tr1和CD4＋CD25＋Foxp3＋T細胞的基因組成發現GATA3（ROG）在Tr1細胞中表達而未在CD4＋CD25＋Foxp3＋T細胞中表達，但是ROG在其他類型的活化的輔助性T細胞中也有表達。

3 Tr1細胞的誘導分化

Tr1是一種誘導型調節性T細胞，現在有很多研究對能夠誘導Tr1細胞分化的因素進行了研究。在體內或者體外某些條件刺激下都可誘導初始CD4＋T細胞向Tr1細胞的分化。

IL－10被認為是誘導Tr1細胞分化最主要的因素，因此IL－10不僅是Tr1細胞的效應分子而且也是其誘導分化的重要調節因子。在體外大劑量的IL－10可以誘導鼠或人的初始CD4＋T細胞向 Tr1細胞分化［3，9］。IL－12家族的成員IL－27是最近研究發現的也能夠誘導Tr1細胞分化的一個重要調節因子［12－14］。在人體CD46、CD3單克隆抗體能夠誘導初始CD4＋T細胞向Tr1細胞分化［15］。初始CD4＋T細胞與耐受性樹突狀細胞（tolerogenic dendritic cell，DC－tol）共培養可誘導其向 Tr1細胞分化［16］，DC在IL－10或半乳糖結合凝集素galectin－1的誘導下可分化發育為DC－tol，DC－tol與初始CD4＋T細胞共培養后也可誘導CD4＋T細胞向Tr1分化［12］。而且該作用與DC細胞分泌IL－27作用于CD4＋T細胞表面的IL－27受體后通過STAT信號通路發揮功能有關［12－13］。除了在體外條件下對Tr1細胞進行誘導分化，在體內條件下也可誘導分化出Tr1細胞。對接受了胰島移植的鼠模型體內給予給予西羅莫司聯合CD45RB單克隆抗體和IL－10也能誘導Tr1細胞的分化，促進其免疫耐受的建立［17］。現在應用這些方法進行體外擴增所得到的Tr1細胞有很大一部分是沒有功能的，從而抑制了Tr1細胞的臨床應用潛能。為了克服體外擴增的障礙，現在也有研究通過基因工程的方法得到轉導有人類IL－10基因的CD4＋T細胞（CD4LV－IL－10）［18］，這類細胞具有 Tr1細胞的功能特點，能夠生成大量的IL－10、TGF－β，抑制同種異體反應性T細胞的活性。在異種移植的GVHD動物模型中，這類細胞能夠抑制GVHD的發生。

4 Tr1細胞與GVHD

Tr1細胞對機體免疫系統發揮著重要的調控作用，現在已有研究表明Tr1細胞能夠抑制GVHD的發生。異基因HSCT是目前治療血液系統惡性腫瘤的最佳治療手段，而GVHD是異基因HSCT最嚴重的并發癥，大部分接受異基因HSCT的患者都會經歷不同程度的GVHD，因而GVHD是目前困擾異基因HSCT移植成功的主要障礙［19］。盡管在移植后使用免疫抑制劑預防GVHD，甚至供體是HLA相合的供者，GVHD仍可發生。GVHD的發生主要是由于供受者間抗原不合，供者T淋巴細胞識別受者同種異型抗原后活化增殖分化為效應T淋巴細胞，對受者組織器官發動免疫攻擊。臨床GVHD主要分為急性和慢性GVHD。現在臨床對GVHD的預防及治療主要是免疫抑制劑的使用以及去除移植物中的T淋巴細胞，現在也有報道使用CD4＋CD25＋Foxp3＋調節性T細胞預防GVHD［20－22］。

研究發現，接受造血干細胞移植的受者在接受移植之前如果體內外周血單核細胞（peripheral blood monocyte cell，PBMC）能夠自發生成大量IL－10，那么在其接受骨髓移植后發生急性GVHD以及移植的相關病死率就比較低［23］。而供體細胞在受者同種異體抗原刺激后分化為生成IL－10的細胞的數量越多，那么受者發生急性GVHD的機會越小，反之亦然［24］。同時對人IL－10啟動子核苷酸多態性的研究發現，體內IL－10的高轉錄水平對造血干細胞移植后受者急性GVHD的發生是一個保護因素［25］。IL－10是Tr1細胞發揮免疫負調節功能的主要效應分子，因此可以將Tr1細胞作為臨床預防GVHD的治療手段。

HLA半相合HSCT為臨床需要進行干細胞移植而未找到相合供者的患者帶來了希望。但GVHD的高發生率仍使患者的病死率未改善。為了減輕移植后GVHD的發生，現臨床除了使用免疫抑制劑外還采用了去除成熟T淋巴細胞的大劑量CD34＋造血干細胞移植，去除移植物中的T淋巴細胞對改善移植后GVHD的發生有很大作用，但移植后由于缺乏有效的移植物抗白血病（graft versus leukemia，GVL）效應而導致的腫瘤復發率增加以及增加了患者致命感染的發生。為了提高臨床HLA半相合HSCT的成功率，研究者將體外誘導得到的同種異體抗原特異性Tr1細胞作為HSCT的輔助治療手段［28］。該方法是在體外將供者T淋巴細胞與受者PBMC與IL－10共培養，然后將誘導分化得到的T淋巴細胞輸注到接受HLA半相合HSCT患者體內。應用該方法誘導分化得到的T細胞中除了有大量同種異體抗原特異性Tr1細胞，還包含了初始以及記憶性T細胞，所以與單純接受移植治療的患者比較急性GVHD的程度較輕，而且未發生慢性GVHD。

基于這些研究基礎，筆者的實驗設計將研究經galectin－1處理的小鼠DC誘導初始CD4＋T細胞向Tr1細胞分化的可能機制，并嘗試應用galectin－1誘導分化得到的小鼠DC來預防小鼠急性以及慢性GVHD的發生。如果該實驗成功，就可在不降低免疫功能及不影響GVL效應的情況下為解決異基因HSCT成功的障礙提供一定的實驗基礎，為臨床GVHD的預防和治療提供新的方向。

綜上所述，Tr1細胞免疫負調控作用對減輕HSCT后GVHD的發生有重要意義，而且Tr1細胞是一種誘導型的調節性T細胞，我們可以通過體外誘導得到一定數量的Tr1細胞用于臨床。但體內Tr1細胞的存在會導致慢性感染以及抗腫瘤免疫不能有效發揮。現在對Tr1細胞治療人類疾病的臨床試驗還較少，對其治療可能的相關不良反應還不是很清楚，因此還需要對這一領域進行更多的實驗研究。

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