超聲激勵微泡“空化效應(yīng)”在腫瘤治療方面的研究進(jìn)展*

劉 娟 綜述，吳鳳林 審校

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院超聲診斷科，廣州 510515)

目前，隨著對微泡造影劑研究的深入，超聲激勵微泡“空化效應(yīng)”在疾病治療中的作用越來越受到重視。所謂超聲空化是指存在于液態(tài)物質(zhì)中的微小氣泡(空化核)在超聲場的作用下被激發(fā)，氣泡不斷地振動、膨脹、收縮乃至崩潰爆裂等一系列的動力學(xué)過程[1]。微泡造影劑作為一種人為的空化核，可增加體內(nèi)空化核的濃度，增強(qiáng)空化效應(yīng)，并減少產(chǎn)生空化效應(yīng)所需的超聲能量。超聲激勵微泡“空化效應(yīng)”可增加細(xì)胞膜通透性、增加細(xì)胞內(nèi)藥物濃度、介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染、開放組織屏障、栓塞腫瘤滋養(yǎng)血管、促溶栓等，具有安全、靶向、無創(chuàng)的特點(diǎn)，已成為超聲醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。本文就該技術(shù)在腫瘤治療方面的研究進(jìn)展及存在的問題綜述如下。

1 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移

細(xì)胞凋亡是一種凋亡相關(guān)基因調(diào)控的自身程序化死亡，細(xì)胞凋亡失衡與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。超聲能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并且超聲聯(lián)合微泡造影劑能夠增強(qiáng)超聲誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，并對腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移有一定的抑制作用。胡劼等[2]通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，新型多聚體微泡攜帶舒尼替尼在超聲作用下對人腎癌GRC-1細(xì)胞生長有明顯抑制作用，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。康娟等[3]報道載多西紫杉醇脂質(zhì)超聲微泡造影劑在超聲作用下能延緩?fù)肰X2肝癌的增殖、促進(jìn)其凋亡，對VX2肝癌具有顯著的生長抑制作用。鐘華等[1]通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了高機(jī)械指數(shù)超聲造影增強(qiáng)其空化效應(yīng)能改變微絲、微管的組裝和分布，對腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移有一定的抑制作用。

另有文獻(xiàn)報道，低頻超聲不僅可以通過細(xì)胞毒作用直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而且可以在基因水平改變腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。Sergeeva等[4]從卵巢癌患者腹水中提取卵巢癌腫瘤細(xì)胞(MCF-7)接受頻率為26.5 kHz的低頻超聲處理15 s，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，處理組卵巢癌細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞毒性作用，且細(xì)胞增殖率下降顯著，而對照組中則未發(fā)現(xiàn)。Tabuchi等[5]報道低頻超聲輻照腫瘤細(xì)胞后可以檢測到腫瘤細(xì)胞193個基因下調(diào)和201個基因上調(diào)，這些下調(diào)基因與細(xì)胞生長、增殖和基因表達(dá)有關(guān)，且與細(xì)胞運(yùn)動、多態(tài)性和死亡有關(guān)。李蓉等[6]研究表明超聲輻照載紫杉醇脂質(zhì)微泡(PLM)可顯著抑制裸鼠SKOV3卵巢癌移植瘤的生長和發(fā)展，其機(jī)制可能是通過抑制P53抑癌基因的突變，下調(diào)了血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的合成與分泌，破壞并減少腫瘤血管再生，從而抑制腫瘤的生長。該方法的應(yīng)用為卵巢癌提供了新的臨床治療途徑。

2 化療增敏效應(yīng)及抵抗腫瘤細(xì)胞耐藥性

隨著對超聲波生物學(xué)效應(yīng)的闡明，超聲被認(rèn)為是一種化療增敏劑[7]，它可協(xié)同化療藥物作用，增加腫瘤細(xì)胞對化療的敏感性。有文獻(xiàn)報道，高強(qiáng)度聚焦超聲(HIFU)治療后，位于治療區(qū)邊緣的腫瘤組織經(jīng)低劑量超聲照射后受到損傷，但未發(fā)生壞死，且對化療藥物的敏感性提高了，一些治療前不敏感的化療藥物于治療后變得敏感[8]。孫艷輝等[9]驗(yàn)證了低頻低劑量超聲能有效逆轉(zhuǎn)SKOV3/MDR1細(xì)胞株的多藥耐藥性，其機(jī)制與降低細(xì)胞膜P-糖蛋白(P-gp)的表達(dá)密切相關(guān)。該實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測獲得超聲(0.3 MHz、1.0 W/cm2)輻照下逆轉(zhuǎn)SKOV3/MDR1多藥耐藥的最適輻照時間，并采用免疫熒光法檢測最適超聲輻照前后多藥耐藥糖蛋白P-gp的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)40 s為逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的最適超聲輻照時間，最適輻照有效逆轉(zhuǎn)了SKOV3/MDR1多藥耐藥性，顯著降低了P-gp的表達(dá)。

3 增強(qiáng)抗腫瘤免疫力

近年來的研究表明，HIFU技術(shù)不僅可以殺死局部腫瘤細(xì)胞，還能增強(qiáng)宿主的抗腫瘤免疫力[10]。周顰等[11]采用HIFU腫瘤治療系統(tǒng)(焦距110 mm、頻率0.8 MHz、時間80 s、聲強(qiáng)1 054 W/cm2)制備的HIFU瘤苗明顯增強(qiáng)了小鼠抗同源腫瘤的免疫力。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HIFU瘤苗組小鼠腫瘤發(fā)生率減低，生存期延長；淋巴細(xì)胞在同源腫瘤刺激下增殖明顯，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)對腫瘤細(xì)胞有特異性的殺傷，且比高溫瘤苗組有更高的增殖率和殺傷率。熊希等[12]報道，相對于聚焦超聲一次輻照治療和假照治療，聚焦超聲二次輻照治療小鼠宮頸癌U14移植瘤后，對再次接種同種腫瘤的抑瘤率更高，體外脾淋巴細(xì)胞對同源腫瘤的殺傷活性更強(qiáng)，機(jī)體發(fā)揮了更強(qiáng)的特異性抗腫瘤免疫作用。夏紀(jì)筑等[13]通過實(shí)驗(yàn)觀察到HIFU治療H22移植性肝癌后，活化的CTL細(xì)胞能到達(dá)同種荷瘤鼠腫瘤局部，并與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，發(fā)揮特異性抗腫瘤作用。

HIFU滅活的腫瘤細(xì)胞能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗腫瘤免疫力的機(jī)制尚不清楚。但研究表明死亡細(xì)胞能否激活機(jī)體免疫與細(xì)胞死亡時某些物質(zhì)的釋放有關(guān)，這是一些被稱作“危險信號”或“損傷相關(guān)分子形式”的物質(zhì)[14-16]，如熱休克蛋白、核苷酸、鈣網(wǎng)蛋白等，它們在細(xì)胞非正常死亡時釋放，作為“危險信號”活化抗原提呈細(xì)胞進(jìn)而激活免疫。文獻(xiàn)報道HIFU輻照促使細(xì)胞釋放腺苷三磷酸(ATP)、乳酸脫氫酶(LDH)、熱休克蛋白60(HSP60)等“危險信號”[17]，HIFU毀損的乳腺癌組織也表達(dá)HSP70[18]，這可能是HIFU滅活細(xì)胞能激活免疫的原因。也有研究指出聚焦超聲的熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)及空化效應(yīng)可使胞漿細(xì)胞核內(nèi)的抗原暴露，致細(xì)胞膜流動性增加，加深了機(jī)體對腫瘤組織的免疫反應(yīng)或通過改變抗原空間構(gòu)象，使免疫原性發(fā)生改變，從而增強(qiáng)宿主對抗原識別能力[10]。

4 介導(dǎo)腫瘤微血管栓塞或抗腫瘤血管生成

腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移依賴于新生血管形成，腫瘤新生血管發(fā)育不完全、結(jié)構(gòu)薄弱、通透性高，對各種理化因素的作用比較敏感，這使得采用微泡增強(qiáng)的超聲空化效應(yīng)破壞腫瘤新生血管，從而導(dǎo)致腫瘤缺血、缺氧，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長，阻止其向身體其他部位轉(zhuǎn)移成為可能。Gao等[19]報道微泡增強(qiáng)的高壓振幅聚焦超聲可引起肝臟微血管破裂、出血及肝細(xì)胞腫脹等急性微血管損傷，從而短暫性阻斷肝臟局部血流灌注。Liu等[20]指出微泡增強(qiáng)的超聲空化效應(yīng)提供了一種新的抗腫瘤血管生成的物理治療方法，該方法具有很大的潛在臨床應(yīng)用價值。該實(shí)驗(yàn)觀察到，采用聲壓為4.8 MPa的高壓振幅脈沖式超聲聯(lián)合靜脈注射脂質(zhì)微泡產(chǎn)生空化效應(yīng)可完全阻斷腫瘤微循環(huán)達(dá)24 h，腫瘤微血管結(jié)構(gòu)遭到破壞，形成彌漫性血腫，并伴隨微血栓、細(xì)胞間水腫及大量囊泡產(chǎn)生，導(dǎo)致大量腫瘤細(xì)胞壞死。Hwang等[21]研究表明微泡造影劑在低頻低功率超聲輻照下能夠破壞血管內(nèi)皮層,進(jìn)而導(dǎo)致血栓表面暴露,促使血栓形成活化,此作用限制了特定部位的血流,能夠阻斷惡性腫瘤組織的血供，引起腫瘤的血管栓塞。

5 介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染、藥物傳輸及腫瘤的靶向治療

為了最大限度地提高化療藥物對腫瘤組織的殺傷力，降低其毒副作用，近年來對靶向微泡的研究應(yīng)用非常活躍[22-23]。在超聲輔助化療或靶向治療時，微泡作為藥物載體或與藥物混同給藥[24]，有助于超聲介導(dǎo)、定點(diǎn)治療，同時微泡還能與其他治療方法結(jié)合。研究表明，微泡在超聲作用下產(chǎn)生共振，導(dǎo)致了細(xì)胞膜紊亂，從而加強(qiáng)了大分子入胞作用，允許其被轉(zhuǎn)運(yùn)；微泡擊破產(chǎn)生微射流和沖擊波反過來引起小孔，這些孔足以使大分子顆粒及基因進(jìn)入細(xì)胞[25]。但也有文獻(xiàn)報道質(zhì)膜形成暫時微孔只適合細(xì)胞攝取小分子(<70 kPa)，而細(xì)胞攝取大分子(70～500 kPa)的介導(dǎo)主要是通過入胞作用實(shí)現(xiàn)的[26]。孔直徑范圍為30～100 nm，最大的為幾微米，它們具有短暫性質(zhì)，幾秒或幾分鐘后，在Ca2+和ATP的作用下通過內(nèi)生囊泡修復(fù)反應(yīng)關(guān)閉[27]。

基于此，微泡作為化療藥物的載體，在超聲作用下使靶細(xì)胞膜的通透性暫時增加并且有助于化療藥物進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，增加化療藥物的局部濃度并減少不良反應(yīng)。張海等[28]自制包裹綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)并攜有前列腺癌雄激素受體抗體的聚乳酸/乙醇酸共聚物(polylactic/poly glycolic acid，PLGA)納米粒(nano polymers，NPs)結(jié)合前列腺癌PC4-2細(xì)胞，利用超聲治療儀進(jìn)行體外輻照，結(jié)果顯示超聲輻照對NPs有體外促降解及靶向控釋DNA作用，達(dá)到靶向抑癌目的。黃品同等[29]通過血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)高表達(dá)的結(jié)腸癌皮下種植瘤Balb/C裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，觀察到靶向VEGFR2脂質(zhì)微泡能增強(qiáng)超聲空化對結(jié)腸癌的治療效果，且較普通微泡去空化效果更佳。Duvshani-Eshet等[30]運(yùn)用治療性超聲輻照前列腺癌細(xì)胞20 min，使其進(jìn)行有效轉(zhuǎn)染，并通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)將PEX傳輸?shù)侥[瘤細(xì)胞中,結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。Emoto等[31]研究表明,在超聲輻射下將攜帶血管生成抑制劑TNP-470的微泡定位于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上,其抗腫瘤的效果明顯增強(qiáng)。廖永玲等[32]通過體內(nèi)研究證實(shí)，超聲輻照攜帶促黃體生成素釋放激素類似物的靶向微泡，能顯著增強(qiáng)順鉑(DDP)對人卵巢癌耐藥細(xì)胞A2780/DDP裸鼠腹腔移植瘤的抑制作用，并通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)表達(dá)，降低腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。

6 展 望

利用超聲聯(lián)合微泡治療腫瘤還處于實(shí)驗(yàn)階段，仍有較多問題亟待解決:(1)靶向性及穩(wěn)定性。加強(qiáng)微泡與配體的結(jié)合力以及配體與受體之間的結(jié)合強(qiáng)度，是微泡具有靶向性的基礎(chǔ)。靶向微泡的構(gòu)建步驟繁瑣而費(fèi)時，其穩(wěn)定性及體內(nèi)尋靶效率均有待提高。因此，如何提高微泡載藥或基因效率，如何提高微泡在循環(huán)中運(yùn)行的穩(wěn)定性，如何延長微泡停留在感興趣區(qū)時間，以及如何有效地控制釋放時機(jī)等是我們需要解決的重要問題。(2)安全性。超聲在殺死腫瘤細(xì)胞的同時也會對鄰近細(xì)胞和組織造成傷害。許多體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)表明[33-34]，微泡存在時，經(jīng)超聲照射的組織可出現(xiàn)溶血、微血管滲漏、毛細(xì)血管破裂、肌鈣蛋白-T增高、心肌損傷，短暫影響左室功能。(3)優(yōu)化參數(shù)。超聲輻照參數(shù)的優(yōu)化(包括輻照時間、聲頻率、強(qiáng)度、占空比、脈沖重復(fù)頻率、超聲波發(fā)射方式、超聲儀器類型等)；微泡種類、濃度及注射方式的優(yōu)化等。

雖然超聲激勵微泡“空化效應(yīng)”在腫瘤治療方面的應(yīng)用仍存在許多問題，但不可否認(rèn)，該技術(shù)的確是一種具有廣闊應(yīng)用前景的無創(chuàng)治療腫瘤的物理方法，是超聲醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中發(fā)展較快的研究熱點(diǎn)之一。隨著技術(shù)的發(fā)展和研究的不斷深入，該方法將在臨床或基礎(chǔ)研究中得到廣泛的運(yùn)用，具有重要的應(yīng)用價值。

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