DNMT1與DNA異常甲基化及腫瘤的關系

王 倩 綜述，唐維平 審校

(南昌大學第二附屬醫院口腔科，南昌 330006)

DNA甲基轉移酶(DNA methyctransferace,DNMTs)是表觀遺傳學中催化并維持DNA甲基化的重要酶家族。在哺乳動物中它分為3個家族：DNMT1、DNMT2、DNMT3[1-2]。DNMT1是DNA進行復制修復并維持其正常甲基化的關鍵酶；DNMT2主要是tRNA的甲基轉移酶；DNMT3包含有3個亞基，3a、3b催化CpG島從頭甲基化轉移酶而3L是一個調節蛋白[3]。DNMT1是DNMT酶家族中最重要也是目前研究最多的一種酶。眾多研究發現DNMT1與DNA異常甲基化有關，并且二者與腫瘤的發生、發展也有密切關系。現就DNMT1、DNA異常甲基化與腫瘤的關系綜述如下。

1 DNMT1與DNA甲基化

1.1 DNMT1的發現、基因結構及生物學功能 DNMT1是1964年Gold和Hurwit等研究人員在大腸桿菌中提取的第1個DNMT。1988年Bestor等[3]克隆出第1個真核生物C5胞嘧啶特異的DNA甲基轉移酶，命名為DNMT1。DNMT1是由1 616個氨基酸殘基編碼成的蛋白質，其相對分子質量183×103，定位在人染色體19p13.2～13.3，cDNA全長為5 434 bp[4]。目前的研究結果認為DNMT1包括3個結構域，即C端的催化端、N端的某些蛋白識別的靶區域及未知區域[5]。有學者發現DNMT1上調發生在DNA甲基化之前，也就是說DNMT1的上調可能是DNA發生異常甲基化的重要原因。另一方面研究人員利用DNMT1抑制劑作用于腫瘤細胞發現能夠一定程度抑制腫瘤細胞生長，說明DNMT1和腫瘤有一定的關系，同時說明DNMT1作用DNA甲基化至腫瘤發生是一個可逆的過程。蘇玉等[6]總結出DNMT1不僅與胚胎發育、細胞衰老有關，也與腫瘤的發生密切相關。DNMT1主要介導甲基化模式的建立與維護，DNMT1高表達致甲基化模式發生異常，抑癌基因沉默、原癌基因激活導致腫瘤發生[7]。

1.2 DNA甲基化與CpG島 DNA甲基化是在DNMTs的催化下，將S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基基團轉移到未進行甲基化胞苷-磷酸-鳥苷(CpG)二核苷酸中的胞嘧啶5′-C原子上形成5-甲基胞嘧啶的過程[8]。在正常生理情況下，啟動子區的CpG二核苷酸有兩種狀態，一種是處于相對集中的非甲基化狀態，另一種是相對分散的甲基化狀態，把相對集中成簇存在的非甲基化CpG的一段DNA稱為CpG島。CpG島一般位于基因的啟動子區，大小為300～500 bp，此區域多為管家基因及組織表達特異基因[9]。CpG島與DNA甲基化有密切關系。2006年Rollins等[10]研究發現不易被甲基化的CpG島(邊界400 bp序列)有豐富的鋅指結構的轉錄因子的結合位點，而80%的結合位點在人和鼠中是保守的。Fan等[11]推測DNA甲基化從甲基化中心結構Alu序列開始向外延伸，當延伸致CpG島周圍密集的轉錄因子結合位點和具有鋅指的結合位點結合以后則可以阻止甲基化向CpG島蔓延，阻止和蔓延達到動態平衡就形成穩定的甲基化模式。當環境發生改變，CpG島啟動子區某些元件發生改變，本可以結合并阻礙DNA甲基化蔓延的轉錄因子的結合能力減弱使阻礙功能變弱甚至消失時，甲基化穩定模式改變。

2 DNMT1、DNA異常甲基化與腫瘤的關系

2.1 DNMT1與腫瘤的關系 研究表明，DNMT1在多種腫瘤中呈高表達。DNMT1是DNA甲基化的關鍵酶，DNMT1活性增加促進DNA異常甲基化。Ang等[12]通過免疫組化和免疫印跡兩種方法研究DNMT1在胰腺癌組織和相應的癌旁組織中的表達，免疫組化結果得出78.7%(37/47)的癌組織中DNMT1呈高表達，而免疫印跡的評價結果得出癌組織中80%(16/20)呈高表達。提示DNMT1的異常激活可能在胰腺癌的發生發展中具有重要作用。G?m?ri等[13]用免疫組化及PCR評價DNMT1在膠質瘤中的表達也得出陽性的結果。Zhang等[14]找到宮頸癌中有異常甲基化的基因，利用RNA干擾技術沉默DNMT1基因的表達，采用qPCR和免疫印跡方法檢測DNMT1 siRNA干擾對DNMT1酶活性的影響，結果表明DNMT1 siRNA能顯著降低宮頸癌中DNMT1的活性，抑制DNMT1在宮頸癌中的表達。通過流式細胞儀和MTT法分別檢測DNMT1 siDNA干擾對宮頸癌細胞的周期變化和細胞生長的影響，得出DNMT1 siDNA干擾能使宮頸癌細胞凋亡率增加。DNMT1在宮頸癌的發生、發展中具有重要作用。Fan等[15]應用免疫組化及real-time PCR分別檢測DNMT1 蛋白和DNMT1 mRNA在肝癌組織及癌旁組織中的表達，得出癌組織DNMT1呈高表達狀態，二者之間表達差異有統計學意義。利用DNMT1抑制劑使肝細胞SMMC-7721凋亡，說明DNMT1使肝細胞中的抑癌基因沉默導致肝癌，同時研究還得出患有乙型肝炎的患者更容易發生DNMT1上調。有人研究在卵巢上皮癌中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b均呈高表達，三者之間的關系呈正相關。Yang等[16]研究DNMT1 基因的多態性(rs 2114724,rs 2228611,rs 2228612,rs 8101866,rs 16999593)與中國南方人口胃癌的發生有一定的關聯，得出DNMT1的rs16999593基因型是南方人口胃癌發生的主要基因。DNMT1在喉鱗狀細胞癌、結腸癌等也有不同程度的表達。

2.2 DNA異常甲基化與腫瘤發生、發展的關系 在生理狀態下，啟動子區的CpG島(CpG二核苷酸聚集區)處于非甲基化狀態，分散的CpG二核苷酸處于甲基化狀態。當DNA甲基化異常時這種狀態被打破，啟動子區的CpG島發生甲基化，導致調控基因表達受到抑制。1988年Feinberg等[17]通過檢測基因組中DNA甲基化胞嘧啶的豐度得出腫瘤組織呈現整體的低甲基化現象，1999年Qu等[18]通過甲基化敏感性酶的重復序列測定得出了相同的結論。研究充分證實基因組啟動子區的CpG島會發生異常甲基化。由此可以推斷，在腫瘤細胞基因組中呈現整體低甲基化伴隨特定區域(CpG島)高甲基化狀態。腫瘤細胞發生這種現象有以下幾種解釋[19-20]：(1)低甲基化使轉錄抑制作用減弱，增加了部分沉默基因及病毒等有害基因的表達，如原癌基因激活,轉座子成分活化。(2)整體低甲基化水平使染色體不穩定基因印記缺失。(3)低甲基化使腫瘤細胞浸潤轉移增加。(4)CpG島高甲基化使轉錄抑制增強，抑癌基因沉默或缺失導致癌細胞過度增殖。隨著表觀遺傳學的發展，DNA高甲基化被認為是繼基因突變、基因缺失之后第3種抑癌基因沉默或缺失的機制。(5)DNA高甲基化沉默DNA修復基因，增加基因組不穩定性。(6)DNA高甲基化所致的基因沉默是DNA發生突變的易感因素，腫瘤的發生機制從表觀遺傳學轉為遺傳學。González-Ramírez等[21]研究得出腫瘤基因啟動子CpG島甲基化是口腔鱗狀細胞癌發生的一個重要因素。文獻[22]也得出相同的結論。口腔鱗狀細胞癌組織中顯示啟動子甲基化的一些主要的基因是細胞周期調控基因(P16)、DNA修復基因(MGMT和hMLH1)及細胞增殖(c-myc)和細胞凋亡基因(DAPK和PDCD4)。Supic等[23]對口腔鱗狀細胞癌手術切除的腫瘤進行相關基因(DAPK等)甲基化檢測，以判斷口腔鱗狀細胞癌的預后。在一些癌旁組織中組織病理結果并無異常，但DNA甲基化檢測存在分子生物學的改變，研究得出手術切緣存在DAPK啟動子異常甲基化患者的生存率與甲基化水平呈反比(P=0.004)。這類患者術后較易復發，預后較差。DNA異常甲基化是腫瘤發生的一個早期事件。

3 DNMT1抑制劑與腫瘤治療的關系

3.1 DNMT1抑制劑的研究 DNA甲基化不涉及基因的改變，因此它是一個可逆的過程，抑癌基因的啟動子在DNMT1的催化下發生異常甲基化使基因沉默，反過來思考，可以通過抑制DNMT1的活性來抑制或阻斷抑癌基因沉默，通過重新激活抑癌基因殺死腫瘤細胞。DNMT1抑制劑的研究成為治療癌癥的新亮點。目前開發的DNA抑制劑主要有核苷(代表有阿扎胞苷、地西他濱等)及非核苷(氨基苯甲酸類、反義寡核苷酸類等)兩大類[25]。作用機制主要有4種：(1)在DNA復制的過程中加入DNA與DNMT1結合。5-Aza-CdR是較早研究的DNMT1抑制劑，是在DNA復制時競爭性的與DNMT1結合，導致DNMT1維持甲基化的水平降低使DNA基因序列從原來的高甲基化轉為正常甲基化。多項臨床試驗證明，它可以激活抑癌基因P16殺死癌細胞達到治療腫瘤的目的[26]。(2)非共價的阻斷DNMT1的活性位點。這類主要有RG108(4)和EGCG(5)，目前還處于臨床前研究階段[27-28]。(3)通過干擾DNMT1與DNA的結合位點。經研究發現抗心律失常藥普魯卡因胺同樣具有抑制DNMT1活性的作用，它可以直接作用于啟動區的CpG島，通過抑制DNMT1的活性，降低DNMT1對DNA的甲基化作用[29]。(4)直接抑制DNMT1的基因表達。通過應用反義寡核苷酸抑制DNMT1的基因表達，從而減少DNMT1的合成 。MG-9是第2代反義寡核苷酸DNMT1抑制劑。有研究表明，可以減少人體細胞中DNMT1蛋白的表達，誘導基因去甲基化。但這類化合物在體內很容易代謝水解，如何提高其穩定性尚需進一步探究[17-19]。

3.2 DNMT1抑制劑的展望 隨著表觀遺傳學的深入研究，DNMT1作為治療腫瘤的表觀基因藥物備受關注。DNMT1抑制劑作為調節高甲基化的重要藥物，已在臨床多種腫瘤治療的研究中得到應用。不同類別的DNMT1抑制劑根據自身的結構、作用機制及作用靶點的不同，其療效、不良反應及代謝途徑也有差別。目前，核苷類藥物是作用機制較為明確的DNMT1抑制劑，地西他濱較阿扎胞苷藥物性能更穩定，對腫瘤細胞的靶作用更敏感。阿扎胞苷實驗效果更理想，但因具有細胞毒性，臨床并未取得顯著效果；大量的實驗研究證明氨基苯甲酸類抑制劑的有效劑量具有較大的不良反應；反義寡核苷酸類抑制劑隨著分子生物學的發展，通過構建DNMT1的特異性結構，特異的阻斷DNA甲基化修飾過程，為治療腫瘤提供了新思路[17]。隨著表觀遺傳學的發展，對抑制異常甲基化的藥物以及他調節表觀遺傳基因失衡的藥物以及這些藥物之間的相互協同作用會有進一步的研究。

4 結 語

DNA異常甲基化與腫瘤的發生、發展有著密切關系,是腫瘤發生的早期事件，DNMT1是催化并維持DNA甲基化的關鍵酶。大量的研究證明DNMT1在組織中的異常表達與腫瘤有著密切的關系，DNMT1高表達催化相關抑癌基因啟動子CpG島發生異常甲基化，DNA甲基化水平的改變是腫瘤的一個特征性變化，往往和惡性腫瘤相關并隨惡性腫瘤的發生、發展而不斷變化。因此，DNA甲基化檢測技術對于腫瘤預防、診斷預后意義重大。但DNA甲基化檢測技術目前只能用于科研還不能服務于臨床。對DNMT1抑制劑的研究目前已有一定的成果，部分藥物用于臨床腫瘤治療取得一定療效，但隨著分子生物學的發展，DNMT1及DNA甲基化與腫瘤的關系尚有一些問題需要進一步深入研究，例如：哪些腫瘤具有特異的DNA甲基化片段？DNA甲基化片段的檢測怎樣才能服務于臨床？怎樣運用DNMT1抑制劑更好的服務于腫瘤？隨著后基因時代的發展，對表觀遺傳學不斷地深入研究，相信會把這些問題搞清楚并服務于臨床。

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