脛骨神經(jīng)損傷對(duì)骨折愈合過程中CGRP表達(dá)的影響

吳洪亮李宗澤

（1 南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，江西 南昌 330003；2 江西省瑞金市人民醫(yī)院骨科，江西 瑞金 342500）

脛骨神經(jīng)損傷對(duì)骨折愈合過程中CGRP表達(dá)的影響

吳洪亮1李宗澤2

（1 南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，江西 南昌 330003；2 江西省瑞金市人民醫(yī)院骨科，江西 瑞金 342500）

目的 研究脛骨神經(jīng)損傷后大鼠脛骨骨折骨痂中CGRP的表達(dá)。方法 將SD大鼠40只分為2組，實(shí)驗(yàn)組20只和對(duì)照組20只，分別于骨折術(shù)后7、14、21、28 d處死大鼠，在骨折處取骨痂標(biāo)本，觀察脛骨骨折愈合過程中脛骨神經(jīng)損傷時(shí)降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）表達(dá)變化。結(jié)果 對(duì)照組骨折后7 d在愈傷組織中即可見到降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）陽性神經(jīng)纖維，沿血管分布，14～21 d在編織骨邊緣有大量的CGRP陽性神經(jīng)纖維，28 d時(shí)仍有較高水平。研究組除骨折后7 d骨痂中見CGRP陽性表達(dá)外，以后骨痂中CGRP表達(dá)逐漸下降，其中術(shù)后14、21、28 d兩組組間CGRP表達(dá)量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 在骨折愈合過程中，骨折合并周圍神經(jīng)損傷不利于骨折愈合，周圍神經(jīng)對(duì)骨折的愈合起著重要的調(diào)節(jié)作用。

神經(jīng)損傷；骨折愈合；降鈣素基因相關(guān)肽

近年來，研究發(fā)現(xiàn)在骨折愈合過程中周圍神經(jīng)系統(tǒng)起到了重要的作用[1]，其主要通過肽能神經(jīng)分泌的相關(guān)神經(jīng)肽對(duì)骨組織起作用[2]，而CGRP在骨組織中分布最廣，并且主要分布在骨代謝活躍的部位。CGRP通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化及活性，從而影響骨折愈合。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)40只SD大鼠建立失神經(jīng)支配的脛骨骨折模型，研究外周神經(jīng)對(duì)脛骨骨折愈合的影響，為改善神經(jīng)功能促進(jìn)骨折愈合提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型建立：選取SD成年健康大鼠40只，體質(zhì)量300 g左右，雌雄不限，隨機(jī)數(shù)字表法分成2組：左側(cè)脛骨骨折組+左側(cè)脛骨神經(jīng)損傷組（實(shí)驗(yàn)組，20只）和單純左側(cè)脛骨骨折組（對(duì)照組，20只）。各組大鼠均用10%水合氯醛350 mg腹腔注射麻醉。A組在無菌條件下從脛骨平臺(tái)前緣插入一根預(yù)制的消毒醫(yī)用克氏針，然后人工固定大鼠后肢。助手將重錘于30 cm高處沿中軸自由落下，通過撞擊托盤將力傳導(dǎo)至刀片上，撞擊脛骨中段造成骨折，脛骨中段前方最高點(diǎn)處為暴力撞擊點(diǎn)，建立左側(cè)脛骨骨折模型[3]。B組常臀部規(guī)備皮消毒后，外側(cè)行長約1.5 cm的斜形切口，切開皮膚及皮下組織，將坐骨神經(jīng)鈍性分離，于梨狀肌出口以遠(yuǎn)1 cm處橫斷切除坐骨神經(jīng)遠(yuǎn)段約0.5 cm，生理鹽水沖洗傷口后在皮下進(jìn)行遠(yuǎn)端翻轉(zhuǎn)縫合，建立左側(cè)脛骨骨折合并脛骨神經(jīng)損傷模型[4]。術(shù)后將所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分籠喂養(yǎng)，并注意保溫，術(shù)后連續(xù)3 d肌內(nèi)注射青霉素，每日3次。為防止感染，局部應(yīng)用碘伏消毒傷口。自來水、市售固體飼料喂養(yǎng)。

1.2 骨痂標(biāo)本制取：各組大鼠分別于建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃?、14、21、28 d，截取脛骨骨折部上下5 mm部位的組織，同時(shí)保護(hù)好骨膜，避免破壞骨痂。去盡軟組織后用4%多聚甲醛固定液固定24～48 h，用10%乙二胺四乙酸鈉充分脫鈣。至針頭輕易扎穿骨皮質(zhì)后，梯度乙醇脫水，二甲苯置換，石蠟包埋，連續(xù)縱行4 μm組織切片，附著于載玻片上置入4 ℃的冰箱中備用。

1.3 X線片檢查：分別于術(shù)后7、14、21、28 d對(duì)各組動(dòng)物骨折側(cè)行X線攝片檢查，嚴(yán)格控制拍片條件：55 kv，10 ms，1.6 mAs，焦距90 cm。觀察各組動(dòng)物骨折處的骨痂生長情況。

1.4 HE染色組織學(xué)觀察：將切片放入二甲苯中將石蠟除去，再經(jīng)95%乙醇到80%乙醇，最后用蒸餾水沖洗。用蘇木精水溶液染色10 min，自來水沖洗5 min，鏡檢，若胞質(zhì)過藍(lán)則以1%鹽酸酒精分化30 s，自來水沖洗5 min。伊紅染液染色5 min，若胞質(zhì)過紅則以無水酒精分化數(shù)秒鐘，自來水沖洗。切片經(jīng)梯度酒精脫水，再次放入二甲苯中，使切片透明。將中性樹膠滴在透明切片上，蓋上蓋玻片封固。光鏡下觀察細(xì)胞核呈蘭色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色。觀察骨細(xì)胞數(shù)量和骨小梁排列。

1.5 免疫組化檢測CGRP的表達(dá)：采用SP法，石蠟切片脫蠟至水，在室溫下，3%過氧化氫孵化10 min，蒸餾水清洗3次，復(fù)合消化液消化20 min抗原修復(fù)，滴加正常山羊血清封閉在室溫下20 min，倒掉血清。滴加一抗工作液置于濕盒內(nèi)4 ℃過夜，次日再置于37 ℃中1 h。滴加二抗工作液37 ℃孵育20 min，滴加鏈霉卵白素37 ℃孵育30 min。最后用新鮮配制的DAB液顯色，蘇木精再次染色，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片封片，鏡檢。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理及圖像分析：應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。計(jì)量資料使用兩樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察：所有動(dòng)物術(shù)后給予青霉素肌注、碘伏消毒傷口，飼養(yǎng)盒單獨(dú)喂養(yǎng)，所有大鼠均無1例感染。但對(duì)照組傷口愈合速度實(shí)驗(yàn)組快，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后腫脹程度及比對(duì)照組重，而且持續(xù)時(shí)間長。

2.2 X線檢查結(jié)果：X射線檢測，術(shù)后7天兩組均無明顯骨痂生長，斷端清晰明確；術(shù)后14 d兩組骨折端均出現(xiàn)局部高密度影，附近存在骨膜反應(yīng)，骨痂量實(shí)驗(yàn)組較多，部分突出于骨皮質(zhì)表面，但密度較差且不均勻；術(shù)后21 d實(shí)驗(yàn)組骨痂量較多，部分繼續(xù)增大突出，但對(duì)照組正常生長，密度較實(shí)驗(yàn)組均勻；術(shù)后28 d實(shí)驗(yàn)組骨架過度生長，明顯突出正常骨皮質(zhì)，密度不均，外骨痂吸收塑形差，對(duì)照組骨折線模糊消失，外骨痂塑形逐漸成熟，密度較均勻，基本接近正常骨皮質(zhì)。

2.3 免疫組織化學(xué)觀察：對(duì)照組術(shù)后7 d骨痂組織中即可見CGRP陽性表達(dá)，沿血管分布；術(shù)后14、21 d均有大量CGRP免疫陽性神經(jīng)纖維分布，術(shù)后21 d較術(shù)后14 d時(shí)減少；術(shù)后28 d仍然較多；實(shí)驗(yàn)組僅術(shù)后7 d骨痂中可見低水平的CGRP陽性表達(dá)。分析結(jié)果顯示，術(shù)后14、21、28 d兩組間CGRP表達(dá)量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

3 討 論

CGRP可調(diào)節(jié)生長板軟骨細(xì)胞的增生、分化及凋亡，同時(shí)，通過對(duì)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的數(shù)量和活性的調(diào)節(jié)，使成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性和數(shù)量達(dá)到平衡，使骨小梁正常重建，共同完成骨骼的形成和塑形過程；同時(shí)，CGRP可間接調(diào)節(jié)骨的礦物質(zhì)代謝與平衡，促進(jìn)基質(zhì)的礦化。本實(shí)驗(yàn)組織學(xué)觀察：對(duì)照組術(shù)后14 d骨小梁形成增加，成熟度較高，排列成柵欄狀；術(shù)后21 d新生骨小梁己相互連續(xù)，排列基本規(guī)則；術(shù)后28 d骨折處新骨連接成片，組織結(jié)構(gòu)基本接近正常組織。室驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)骨小梁生長稀疏，排列不規(guī)則，類骨質(zhì)較厚，成熟度不高，同時(shí)可見骨吸收空腔。進(jìn)一步證實(shí)周圍神經(jīng)損傷對(duì)骺板的正常發(fā)育造成了一定的影響，限制了骨骼的縱向生長；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組骨基質(zhì)礦化質(zhì)量下降，進(jìn)一步在組織學(xué)方面證實(shí)了，骨痂愈合過程中骨形成受到受限并骨質(zhì)出現(xiàn)疏松。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)對(duì)照組術(shù)后14、21 d有大量CGRP免疫陽性神經(jīng)纖維分布，術(shù)后28 d水平仍然較高，而實(shí)驗(yàn)組僅術(shù)后7 d有極少CGRP表達(dá)，術(shù)后7、21、28 d兩組比較均有顯著差異（P＜0.05）。進(jìn)一步證實(shí)，周圍神經(jīng)損傷后，CGRP分泌進(jìn)行性減少、消失，對(duì)骺板生長發(fā)育調(diào)控作用消失，影響骨骼生長。這證明了周圍神經(jīng)組織通過神經(jīng)肽物質(zhì)對(duì)骨折愈合發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

表1 CGRP免疫組化染色的平均光密度值比較（xˉ±s）

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R683.42；R745

：B

：1671-8194（2014）32-0068-02