腦缺血性中風抗血栓治療的研究進展

熊亞楠

(連云港中醫藥高等職業技術學校，江蘇連云港 222007)

中風是由于腦部供血受阻而迅速發展為腦功能損傷的疾病，可分為缺血性中風和出血性中風。大約80%的中風是由動脈閉塞引發的腦缺血造成的，即缺血性中風;超過20%是由顱內出血引起的，即出血性中風。中風已成為世界第二大致死原因。缺血性中風治療目的在于清除血栓，恢復缺血腦組織的供血，但同時又避免腦出血現象的發生。由于缺血性腦中風的病理生理機制極為復雜，因此不同機制采取需不同的治療方法，主要包括超早期溶栓治療，急性期抗栓治療，以及神經保護藥物使用等。目前對于引發和維系腦血栓形成的分子途徑仍然存在很多未知，常用的血小板抑制劑如乙酰水楊酸(ASA)和抗凝劑如低分子量肝素、重組組織纖溶酶原激活劑(tPA)，因治療時間窗要求較短，且可增加出血危險，所以其臨床應用一直受到一定的限制。中風的治療仍然需要更有效更安全的抗血栓藥物［1］，其中血小板和凝結因子作為首要的靶點得到越來越多的關注。本文綜述了在中風小鼠模型實驗中有關血小板和凝結物新的病理生理學觀點，這些基礎研究將激發“無出血抗血栓”的概念，期待這將在未來的臨床試驗中得到實現。

1 血栓形成的基本機制

在正常的生理狀態下，人體內有著復雜精細的調節機制，因此血栓不會輕易形成。當血管受損后，暴露的內膜組織可以激活血小板和血漿中的凝血系統，由纖維蛋白和血小板共同組成止血栓子，有效止血。正常的血管內皮細胞具有抗栓特性，它通過表面負電荷，釋放各種物質，防止血小板黏附、聚集，促進纖維蛋白溶解、抑制血液凝固過程，使體內血液保持液體狀態及血管暢通起著重要的作用，防止血栓形成。這個調節機制依賴于人體內促凝血物質和抗凝血物質的動態平衡。

當人體處于疾病狀態時，人體的凝血和溶栓機能失常，導致促凝血物質和抗凝血物質的動態平衡遭到破壞，其原因包括血管內皮細胞損傷、血流狀態改變、血液凝固性增高等。當內皮細胞受到機械、感染、免疫、化學物和代謝產物等損傷時，內皮細胞脫落而導致內皮下組織暴露，或各種先天性疾病中的內皮細胞功能缺陷時，血管壁抗栓作用減弱，同時，血管壁中存在的潛在促血栓形成機制產生了有利血栓形成的變化，如vWF、組織因子(TF)等。因此，血管內容易形成血栓凝塊，堵塞血管，甚至危及人類生命健康。血栓如果形成在腦動脈血管中，將會導致腦血栓和缺血性中風。

2 血小板為靶點的治療

血栓形成是一個受到多因素調節的復雜過程，其中血小板在破損血管壁處的初始粘附、血小板的穩定粘附、以及血小板聚集等是止血的必要步驟也是導致閉塞性血管病變關鍵環節［3］。在血管損傷處，內皮細胞外基質(subendothelial extracellular matrix，ECM)暴露在血流中，激發血小板附著并活化血小板(初級止血)，然后激發凝血系統(二級止血)，初級和二級止血協同形成富含纖維蛋白的血栓來堵住傷口，啟動傷口愈合。ECM中包含多種黏性大分子，如層黏連蛋白、纖連蛋白和膠原蛋白。血小板能夠通過特異性受體連接到這些大分子上，這些特異性受體在止血級聯反應中有不同的作用［4］。血小板在損傷處附著的機制很大程度上決定于血液流變條件。流動的血液相鄰的層產生剪切力，其中血管壁上的力最大，阻礙血小板的黏附和聚集。在動脈血管中高剪切力條件下，血小板開始被束縛到損傷血管壁的內皮細胞基質上，完全依賴血小板受體糖蛋白(glycoprotein，GP)Ib和血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)的相互作用。GPIbvWF結合并不產生穩定的血小板黏附而是降低血小板的流動速度從而使得它們與高度致血栓膠原蛋白相互作用［5］，這一過程由免疫球蛋白超家族受體GPVI介導。GPVI是有效的信號-能量轉換受體，只在血小板及其前體巨核細胞中表達。GPVI連接介導血小板完全活化，胞內鈣離子濃度增加［6］。細胞內外信號的相互作用上調了整合蛋白受體的功能，主要是GPIIb/IIIa通過血漿纖維蛋白的連接形成穩定的血小板-ECM的連接和血小板聚集，以進一步穩定血栓。腦缺血性中風中血栓形成機制也大致相同［7］。

血小板在動脈血栓和心血管疾病的發展中起到了非常重要的作用。沒有哪個單細胞像血小板這樣引起疾病的高發病率和高死亡率。通過封閉血小板粘附和聚集的相關分子通路，來抑制血栓的形成。因此，它也是抗血栓治療的主要治療靶點，為治療腦缺血性中風提供新思路。

2.1 封閉 GPIb-VWF軸 在血流高剪切力條件下GPIb-vWF對于血小板的黏附起到重要作用，因此GPIb-vWF發展成為新的抗血栓因子。在最近幾十年內，通過各種實驗動脈血栓模型驗證了GPIbvWF抑制劑抗血栓的功效［8］。然而，GPIb-vWF對腦局部缺血的作用機制仍然不清楚，在最近的研究表明GPIb-vWF與中風的發展是相關的。蛋白 Ibα(GPIbα)是 vWF的血小板表面受體，通過蛋白間的相互作用血小板可以黏附在受損的血管壁上并進一步聚集，最終導致血栓的形成。

首先，Kleinschnitz等實驗顯示小鼠用抗GPIbα藥物在大腦中動脈閉塞(tMCAO)小鼠模型上急劇降低了中風的梗死面積和大腦功能缺陷［9］。研究表明GPIb在腦缺血或再灌注損傷中動脈血栓的形成起到重要作用［10］，GPIb與VWF連接對于血小板粘附是必須的。vWF是巨核細胞和內皮細胞產生的多聚糖蛋白。缺乏vWF導致了常見的出血性疾病血性管血友?。?1］。為了更深入的了解vWF不同區域的作用，De Meyer等轉入不同的vWF突變基因到vWF缺陷小鼠中。這項實驗顯示vWF連接膠原蛋白和GPIba，而不是GIIb/IIIa，這是中風發展的必要步驟，抑制vWF與膠原的連接是預防血栓的藥理學靶點［5］。這些結果顯示 GPIb-vWF軸對于腦缺血/再灌注病理性血栓的形成至關重要。Momi S等在guinea豬實驗中風模型上用納米抗體ALX-0081針對vWF的A1結構域，阻止vWF結合GPIb，有效的溶解顱內新的血栓形成并減少腦梗死體積，并且沒有引起顱內出血［12－13］。

有研究顯示其他機制如提高vWF的活性同樣增加中風的危險。vWF的活性是由去整合素樣酶、金屬蛋白酶和血小板反應素13(ADAMTS13)共同調節的。vWF的活性與多聚體的體積有關，巨形vWF多聚體甚至可以自發形成微血栓。為了防止自發性血栓的形成，巨形的vWF往往被ADAMTS13裂解為小的低活性的分子。缺乏ADAMTS13活性導致血栓性血小板減少性紫癜，包括腦在內的許多器官中微血栓閉塞血管［14］。Fujioka等發現 ADAMTS13缺陷小鼠比野生型小鼠患中風幾率大大提高［15］，進一步證實vWF在中風后腦血管血栓形成中起到重要作用。相反，將野生型小鼠給予ADAMTS13處理，梗死灶變小，并無致敏性腦出血［16］。這顯示抑制GPIb-VWF相互作用，同時裂解VWF本身可能將成為中風治療的新策略。

2.2 封閉GPVI 血小板GPVI對于將血小板穩定地粘附于裸露的膠原蛋白上至關重要，它能引發強烈信號使血小板活化。GPVI是來自免疫球蛋白超家族的I型受體并且只在血小板上表達［17］。在體內和體外實驗中用特異性抗體封閉GPVI能非常有效的防止血栓的形成。Al-Tamimi M等發現在急性腦缺血病人中，血漿中可溶性GPVI水平顯著提高，這顯示了激活GPVI在中風發病有潛在的作用［18］，可溶性GPVI有望成為診斷缺血性中風的新的標志物［19］。Kleinschnitz C等為了研究 GPVI是否對中風損傷起作用，用抗-GPVI抗體在tMCAO小鼠模型上進行實驗。在tMCAO小鼠模型上60 min后給藥，抑制 GPVI在一天內顯著降低了梗死的體積［19］。這種治療過程是安全的，并沒有增加出血并發癥。Goebel S等用特異性連接GPVI胞外區域的Fc融合蛋白——Revacept在實驗性中風小鼠模型中同樣能減少動脈血栓形成，減小梗死面積和防治缺血性中風后引發的腦水腫，提高神經功能并且無顱內出血。Revacept可以同時阻止GPVI和vWF介導的血小板粘附和聚集，因此有望成為治療缺血性中風及其并發癥的強有力的工具［20］。

2.3 抑制GIIb/IIIa通路 GIIb/IIIa通路對介導血小板不可逆聚集和隨后血栓增長至關重要。因此，藥物抑制這個血小板活化通路已經成為備受青睞的抗血栓策略［21］。抑制 GIIb/IIIa并不能改善tMCAO小鼠模型中風面積的大小或是提高神經功能，治療結果反而導致顱內出血和死亡率的大幅增加。為了更好的療效，通過GPIbα或GPVI的抑制劑來阻止血小板的早期附著，這樣的結果乍看起來似乎有悖常理。然而，GPIbα能夠連接vWF以外的分子，如血管內皮細胞上的P-選擇素和白細胞上的Mac-1。因此，Stoll G等認為抑制GPIbα比抑制GIIb/IIIa更加積極的影響微血管功能障礙的若干機制，如血栓和炎癥，從而提供更廣闊的神經元損傷保護［22］。早期研究表明在實驗中風模型中不同的GIIb/IIIa受體拮抗劑提高了神經功能修復，但是卻伴隨著劑量依賴性顱內出血的增加。Adams HP等證實GIIb/IIIa受體拮抗劑阿昔單抗(Abciximab)在治療急性缺血性中風三期臨床試驗中同樣有出血問題［23］。這項研究過早的停止是因為出血并發癥顯著增加并且治療組缺乏有效的療效。替羅非班(Tirofiban)在治療急性缺血性中風時，能降低6個月的死亡率，但是在改善神經功能和致殘率上沒有效果［24］。Torgano G等研究在中風后6 h替羅非班和阿司匹林的療效對比，未發現替羅非班在短期神經功能提升和長期致殘率降低方面比阿司匹林更好［25］?；谂R床的有限應用，眾多制藥發展計劃停止，GIIb/IIIa受體拮抗劑在中風的分子通路有待更深入的研究，并且其藥理學效果還需有所改善。GIIb/IIIa通路對于血栓形成還是非常重要的環節，希望未來可以找到配體整合酶抑制劑設計的固有問題，研發出新型GIIb/IIIa抑制劑。

3 凝血級聯系統作為靶點的治療

活化的血小板通過兩條途徑來激活凝血級聯系統。首先，通過帶負電荷的磷脂酰絲氨酸(PS)為凝血因子提供高親和位點，從而產生FXa和凝血酶。其次，活化的血小板釋放出帶負電的無機聚磷酸鹽(PolyP)以激活FIX，這是激活內源性凝血系統的起點［26］。凝血級聯系統由幾個連續相連的絲氨酸蛋白酶組成。激活的凝血級聯系統導致凝血并最終生成纖維蛋白，從而穩固了血小板血栓塊。

早期實驗抑制特定的凝血系統構成要素，如FIXa和FXa，得到了有前景的新發現。在大鼠血栓栓塞中風模型中，抑制FXa減小血栓的體積并提升神經效能而沒有出血的風險。同樣，抑制FIX有同樣的效果。低劑量FIX抑制劑在缺血性中風中起保護作用，卻不會引起顱內出血，而高劑量則會引起腦出血，與肝素和tPA相似。還需要大量的研究來確立這些凝血系統中重要組分在治療中風中的安全性和有效性［27］。

近些年，另一個因子FXIIa作為防止血栓形成的候選者正引起人們的興趣。FXII一直被認為與血栓形成無關，即使在血管損傷時FXII缺乏與出血因素也沒有關聯。然而，這個觀點在近幾年有所改變。FXII缺陷小鼠顯示在動脈血管壁損傷不會形成穩定血栓塊，但是也不會增加出血率［28］。缺乏FXIIa在實驗性中風中同樣會發生有趣的現象:患有tMCAO的FXII－/－小鼠與同樣患病的野生小鼠對比栓塞體積明顯減小，約為50%，并且嚴重的神經損傷減少。在中風后組織學分析顯示腦毛細血管中微血管血栓明顯減少。同樣FXI－/－小鼠患tMCAO后可以避免了腦血管閉塞引發的血栓形成和中風，進一步顯示在中風中內源性凝血通路對病理性血凝塊具有一定的作用［29］。從安全的角度看，缺乏FXII活性不會發生顱內出血。

從轉基因小鼠模型中得到的結果，從機制角度看是激動人心的，但這并不代表臨床的療效。如果想治療病人，有效的藥理抑制劑是必須的。FXIIa的選擇性抑制劑是rHA-Infestin-4的重組蛋白，為Kazal型絲氨酸蛋白抑制劑，最初從Triatoma infestans吸血昆蟲的腸道中分離出來的。與FXII－/－小鼠表現出來的抗血栓表型相同，這種物質在不同的大鼠和小鼠血栓模型幾乎完全阻止血栓形成，而沒有延長尾部出血時間［30］。另外，用 rHA-Infestin-4預處理小鼠在tMCAO之后顯著降低中風面積和減少神經功能性缺陷［30］。關于rHA-Infestin-4的新研究正在進一步的測試中，以確定它在中風模型中對血栓栓塞的效果。rHA-Infestin-4同樣會抑制FXIIa的活性。盡管FXII有很好的臨床前數據，但是在人體中風的病理生理上的具體作用還未確定，需要進一步深入的臨床試驗數據。

4 結語

綜上所述，理想的抗血栓藥物除有良好的療效外，需不增加出血的風險尤其在大腦，微小的顱內出血能引發非常嚴重的后果。通過GPIb-vWF-GPVI通路來介導血小板的附著和激活并且后續FXII的活化構成了急性腦缺血中風的重要病理機制。相應的藥物也先后進入臨床前后期研究臨床研究，包括rHA-Infestin-4、抑制GPIb-VWF通路的適體、人源化抗-VWF抗體和GPVI的融合蛋白Revacept等，通過進一步的實驗來確定其安全性和有效性，它們是腦缺血性中風抗血栓治療的研究熱點。相信通過研究人員的不懈努力，“無出血抗血栓”在缺血性腦中風的治療中必將會實現。

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