玻璃酸鈉對骨關節炎患者膝關節液中miR-140表達的影響

張明，王鐵軍，劉書茂，黃東明，李輝，高飛，李悅，杜堯

(1.北京市大興區人民醫院骨科，北京 102600；2.中南大學湘雅二醫院創傷骨科研究室，湖南 長沙 410011)

骨關節炎(Osteoarthritis，OA)是一種常見的慢性退行性關節疾病。其主要病變特征是細胞外基質合成不足導致的關節軟骨退變、繼發的骨贅形成和累及滑膜。女性的發病率高于男性。其發生率隨年齡的增長而升高，據統計我國50 歲以上人口發病率為5%，膝關節骨關節炎的發病率為9.56%；60 歲以上人口發病率為20%，其中膝關節骨關節炎發病率占49%[1]。其發病機制與多種因素相關，但尚無確切的機制。我們前期的研究結果表明骨關節炎患者膝關節液中微小RNA-140(micro RNA-140，miR-140)的表達是下調的，且與骨關節炎的嚴重程度呈負相關[2]。本研究旨在檢測玻璃酸鈉注射液治療骨關節炎前后miR-140的表達、膝關節HSS評分變化，探討miR-140在骨關節炎發病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 患者 按照美國風濕病學會(American rheumatism association，ARA)制定的診斷標準[3]，選取不同Kellgren-Lawrence分級骨關節炎患者，Ⅰ級組治療前后各10 例、Ⅱ級組治療前后各10 例、Ⅲ級組治療前后各10 例、Ⅳ級組治療前后各10 例，最小年齡38 歲，最大年齡90 歲，平均年齡62.1 歲，男性15 例，女性25 例。所有實驗對象均來自于中南大學湘雅二醫院創傷骨科研究室，行玻璃酸鈉膝關節腔注射治療，治療前抽取關節液，一次2 mL，1周1次，5周一療程，治療后1周抽取關節液，置于15 mL無菌、無酶的離心管中備用。同時對每個患者治療前后行HSS評分。本研究方案得到了中南大學倫理學委員會認可，全部標本收集于2010年6月至2010年12月。

1.2 材料 玻璃酸鈉注射液(施沛特)為山東博士倫福瑞達制藥有限公司提供。PCR熱循環儀購自美國Applied Biosystems公司(型號：2700)；實時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司(型號：StepOneTM)。TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit購自美國Applied Biosystems公司。TaqMan MicroRNA Assays試劑盒購自美國Applied Biosystems公司。TaqMan 2×Universal PCR Master Mix Ⅱ(no UNG)購自美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法 采用HSS膝關節功能評分表對所有研究對象進行評分。采用Trizol一步法提取Total-RNA(裂解、分層、RNA沉淀、RNA洗滌和RNA溶解)。反轉錄合成cDNA，反應體系見表1，反應條件(16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min)，選擇OD260/280值在1.6～2.1之間的Total-RNA標本，每次反應Total-RNA量為100 ng。實時熒光定量PCR檢測miR-140和U6snRNA，反應體系見表2，反應條件(95℃ 10 min，95℃ 15 s及60℃ 1 min)，后2步共50個循環。在相對定量分析中，熒光定量PCR的結果以Ct值顯示。用2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量[4]。

1.4 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件對所有數據進行統計學分析。治療前后的樣本PCR檢測結果應用獨立樣本配對t檢驗進行分析，組間比較采用ANOVA方差分析，檢驗水準取α=0.05。OA嚴重程度與治療前后miR-140表達水平變化之間的關系采用Spearman等級相關秩檢驗。

表1 反轉錄反應體系成分及體積

表2 實時熒光定量PCR反應體系的成分及體積

2 結 果

2.1 治療前后HSS評分、miR-140表達水平結果 與治療前相比，HSS評分升高，miR-140在骨關節炎患者膝關節液中的表達水平上調。Ⅰ級組、Ⅱ級組、Ⅲ級組治療前后HSS評分、miR-140表達水平差異有統計學意義(P<0.05)，Ⅳ級組治療前后HSS評分、miR-140表達水平差異無統計學意義(P>0.05)(見圖1～2)。

圖1 治療前后HSS評分比較

2.2 組間比較及相關性分析 Ⅳ級組HSS評分、miR-140的表達改變與Ⅰ級組、Ⅱ級組、Ⅲ級組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；骨關節炎的不同分級與miR-140的表達改變呈負相關(r=-0.825，P<0.05)。

3 討 論

骨關節炎又稱退行性關節炎，可分為原發性和繼發性。原發性骨關節炎的發病機制尚不清楚，可能與高齡、女性、肥胖、職業性過度使用等因素有關；繼發性骨關節炎與代謝異常、機械性或解剖學異常、內分泌異常、炎癥性關節疾患、神經性缺陷等因素有關。OA的主要臨床特點是：關節疼痛、腫脹、畸形、功能受限，好發于膝關節，很難逆轉，治療困難。病理特征：a)關節軟骨軟化，彈性降低，纖維變性，可有碎裂、剝脫、軟骨下骨質外露；b)滑膜大量增殖、水腫；c)軟骨下骨增生，骨小梁增粗；d)關節囊可發生纖維變性和增厚，限制關節活動，周圍肌肉發生保護性痙攣，出現關節畸形。其發病機制迄今為止尚不完全清楚，可能是多種因素共同作用的結果。OA嚴重影響人們的生活質量，給社會及家庭帶來沉重負擔，所以研究其發病機制及有效的治療方法具有十分重要的價值。

圖2 治療前后miR-140相對表達量的比較

玻璃酸是一種線形酸性粘多糖，由N-乙酰葡糖胺和葡糖醛酸二糖單位反復聯接組成，在關節內由滑膜B細胞分泌，是關節滑液和軟骨基質內的重要成分[5]。玻璃酸鈉的主要生理功能有：a)參與細胞外液中電解質和水分的調節；b)關節和細胞間潤滑作用；c)與蛋白糖亞單位結合構成蛋白多糖聚合物，組成軟骨基質；d)透明質酸鈉還可通過修復生理屏障、分子篩作用、促進自身玻璃酸鈉合成、穩定痛覺感受等作用治療OA。玻璃酸鈉能增強關節液粘稠性和潤滑功能，進入軟骨基質與糖蛋白結合，促進軟骨愈合和再生；改善滑液組織的炎癥反應，降低血清與滑膜液中IL-1、IL-6水平，抑制免疫損害進程并緩解疼痛[6]。1974年，Peyron和Balazs首次用玻璃酸鈉治療26 例OA患者，取得了良好的效果[7]。進入21世紀以來，國內、外大量研究證實玻璃酸鈉對膝OA的近期及遠期療效是肯定的，2000年美國風濕病學會(ACR)把玻璃酸鈉寫入髖、膝OA治療指南[8]。玻璃酸鈉治療OA，能夠向患者補充外源性的玻璃酸鈉，提高關節液內玻璃酸鈉的含量，使軟骨表面形成自然屏障，減輕或消除了關節的摩擦，改善了滑膜的生物學功能，恢復和穩定關節內環境，重建膝OA關節內已被打亂的平衡系統[9]。本研究表明玻璃酸鈉治療輕、中度膝OA療效明顯，而對重度膝OA療效不明顯。

miRNA是一類內生的小RNA，長度約19～25個核苷酸組成，是發夾結構的單鏈RNA，大約有70～90個堿基對，由前體經過Dicer酶加工后生成。它們不參與蛋白質的編碼，但是可以調節基因的表達，一個miRNA可以調控多個基因的表達，幾個miRNAs也可以共同精細調控一個基因的表達。MiR-140是micRNAs家族中的成員之一。2006年Tuddenham等[10]通過小鼠胚胎研究miRNA-140在骨關節炎的發病過程中的作用，實驗方法包括DNA的構建、原位雜交、質粒轉染、熒光素酶分析，結果顯示小鼠胚胎發育過程中miR-140在很多軟骨組織(如顱骨、四肢骨、肋骨、胸骨的軟骨部分)當中特異性表達，并且證明miR-140潛在的靶基因是組蛋白去乙酰化酶-4。2007年Johann等[11]研究發現在斑馬魚腭的發育過程中，miR-140基因可以負性調節血小板衍生生長因子(Platelet Derived Growth Factor，簡稱Pdgf)信號途徑，在Pdgf受體蛋白水平，Pdgf受體當中包含負性調節作用的miR-140結合位點，表明miR-140與軟骨的發育有關。有研究結果發現miR-140具有軟骨細胞分化相關的表達模型，miR-140在軟骨發育和體內平衡過程中發揮關鍵作用。2010年Miyaki等[12]通過敲除miR-140目標基因，建立老鼠動物實驗模型，研究結果顯示miR-140可以調節軟骨的發育，miR-140缺失導致了蛋白多糖的丟失和關節軟骨的纖維化，符合年齡相關的OA樣改變。我們研究小組在2011年采用實時熒光定量的PCR檢測miR-140，研究表明人膝關節液中有miR-140表達，在OA患者表達是下調的，且與OA嚴重程度呈負相關[2]。

本研究證實玻璃酸鈉治療OA是有效的，同時miR-140表達與治療前相比是上調的，且與OA嚴重程度呈負相關。說明miR-140可能在OA的發生、發展過程中起著重要作用。為進一步研究miR-140在OA發病機制中的作用奠定理論基礎。通過本研究尚未確定OA與miR-140之間的因果關系，在我們后續研究中需要通過動物實驗、下游靶基因調控進一步證實。

參考文獻：

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