miRNA145作為抑癌基因在胃癌中的表達及其功能研究

劉 莎，孫國平

(安徽醫科大學第一附屬醫院腫瘤內科，安徽合肥 230022)

Lee等在1993年第一次在線蟲中證明了miRNA的存在，命名為lin-4，lin-4的目標基因為異時性開關基因let-7，可作用于胚胎的后期時序發育［1］。miRNA由18～25個核苷酸組成，是一類靶基因為mRNA的3'非編碼區或編碼區的內源性非編碼的短鏈小分子RNA，通過完全互補(植物中常見)或不完全性互補結合(哺乳動物中普遍)的方式抑制轉錄后蛋白的翻譯［2－3］。具體過程如下:Pri-miRNA 是在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉錄生成的，可長達7 000 nt，然后又被RNaseⅢ Drosha及其輔助因子Pasha迅速切割成約70 nt左右莖環狀的的Pre-miRNA(其結構與mRNA相似)。初步剪切完成后，PremiRNA、細胞核/細胞質中的轉運蛋白Exportin-5、G蛋白因子Ran形成復合物，由核內再轉運到胞漿中。在胞漿中，pre-miRNA在Dicer的作用下被切割成長約為22個核苷酸的雙鏈miRNA，成熟miRNA和其互補序列的miRNA形成的雙螺旋解旋后，一條鏈被降解，另外一條成熟的單鏈miRNA保留在RISC(RNA-induced silencing complex)復合體中，成為成熟的miRNA。最后，復合體與靶mRNA的位點相結合參與基因調控［4］。最近有研究表明，人類基因的1/3可能被miRNA調控，而且每個miRNA又能作用于幾百個目標基因［5］，miRNA無疑是腫瘤的發生發展及細胞的增殖、分化、凋亡方面的關鍵因素［6］。另外，越來越多的研究表明miRNA在腫瘤中發揮促癌基因或抑癌基因的作用。

2 miRNA145的起源結構及生物學特性

Lagos-Quintana等在小鼠心肌細胞中第一次發現 miRNA145［7］;隨后，Micheal等在人類結直腸中再次證實了它的存在［8］。miRNA145 長約4.09 kb，其編碼基因位于第5號染色體長臂3區2帶(5q32)，具有莖-環樣結構的前體，經過酶切后形成由23個堿基構成的成熟的miRNA145。起源于人類中胚層的器官或組織含有更多的miRNA145，它是調節平滑肌細胞增殖和分化的關鍵因素［9－10］。miRNA145定位于血管平滑肌細胞 VSMC，當血管受到損傷時，VSMCs中的miR-145表達水平很快下調，調節血管的損傷修復促進血管內膜的形成［11－12］。miRNA145 與 miRNA143 位于同一個初級轉錄產物上，兩者相距較近(不到2 kb)，且有研究證明miRNA143和miRNA145具有相同的功能及協同的作用，故以此推斷它們來自同一個初級轉錄本［13］。大量試驗表明，miRNA145在多種類型的腫瘤組織中表達明顯減少，其中包括胃癌［14］、結直腸癌［15］、食 管 癌［16］、乳 腺 癌［17］、卵 巢 癌［18］、宮 頸癌［19］、前列腺癌［20］、膀胱癌［21］、肺癌［22］、肝癌［23］、胰腺癌［24］、鼻咽癌［25］、骨肉瘤［26］、脂肪肉瘤、尤文肉瘤和白血病等，并且能夠抑制腫瘤細胞的增殖生長、侵襲轉移及凋亡等多個環節，均提示其發揮著抑癌基因的作用。miRNA145主要調控mRNA轉錄中和轉錄后階段，雙向作用于信號通路［27］。目前發現的miRNA145在胃癌中的目標靶基因有IRS-1、β-actin、N-cadherin和 Ets1;在結直腸癌中的有FLI1、DFF45和 ERK5;在食管癌中的有 FSCN1;在乳腺癌中的有RTKN和ER-α;在卵巢癌和宮頸癌中的分別是p70S6K1和BCL-2;在前列腺癌中的有ERK5、KRAS和FSCN1;在膀胱癌中的有COX-2和FSCN1;在肺癌中的有c-Myc;在肝癌中的有MUC1;在骨肉瘤中的有VEGF(血管內皮生長因子)等。

3 miRNA145與胃癌細胞增殖、生長的關系

胃癌是全球最常見的四大惡性腫瘤之一，并且是導致癌癥相關死亡率高的原因之一［28］。在全球范圍內，胃癌發病率在男性惡性腫瘤中僅次于肺癌，占第二位，在女性惡性腫瘤中居第4位。2008年，全世界大約有989 000例胃癌的新病例和738 000與之相關的死亡人數，每年超過70%的病例(約714 000例)發生在發展中國家，并且大約50%的胃癌發生在亞洲的東部［29］。我國是胃癌的高發國家，且胃癌在我國的各種惡性腫瘤中居首位。男性胃癌的發病率和死亡率均高于女性，男女之比約為2∶1，發病年齡以中老年居多(55～70歲高發)，平均死亡年齡為61.6歲。胃癌的病因目前尚未完全清楚，可能與地域環境、飲食生活因素、化學因素、幽門螺桿菌感染、癌前疾病(如慢性萎縮性胃炎、胃潰瘍、胃息肉、殘胃炎等)和癌前病變(腸型化生和異型增生)、遺傳基因因素等有關。

經研究表明，胃癌經常伴有多種miRNA的異常表達，尋找特異性miRNA對于胃癌的診治有著重要的意義。Takagi等的研究顯示，miRNA145在人胃癌樣本中表達下調，并且通過轉染方式過表達miRNA145可以抑制體外胃癌MKN-1和KATO-III細胞系的增殖和生長［30］，有關生物信息學數據還表明，IRS-1的3'-UTR和 β-actin基因中的某個區域與miRNA145中的目標種子區是完全互補的，因此推斷IRS-1和β-actin是影響胃癌細胞增殖和生長的可能候選靶基因［31］。另外，Gao等的研究表明，miRNA145 在BGC-823，SGC-7901，MKN-45，MKN-28四個胃癌細胞系并沒有影響細胞生長和增殖;同時Spearman等人的相關試驗表明，miRNA145的表達水平在人類胃癌樣本中與腫瘤大小之間沒有相關性。不同研究結果的差異性最可能來源于miRNA作用的細胞和組織特異性［32］。但是目前，已有報道稱大多數miRNA在發起或抑制腫瘤轉移的同時可能影響細胞的生長，細胞生長也會影響到轉移的過程［33－35］，更深層次的機制還需要進一步的探索。

4 miRNA145與胃癌侵襲、轉移的關系

4.1 miRNA145與胃癌侵襲轉移的關系 惡性腫瘤的侵襲和轉移往往導致癌癥的相關死亡［36］。Tchernitsa等通過芯片以及RT-PCR方法檢測20例胃癌患者標本，在淋巴結轉移腫瘤與非淋巴結轉移腫瘤組織中，miRNA145表達存在顯著差異，提示miRNA145與淋巴結轉移相關［37］。同時，在Gao等的研究中，miRNA145在胃癌組織中的表達水平比相應非腫瘤組織低32.35倍，體外試驗中 miRNA145的異常表達和功能喪失表明其能夠抑制侵襲和轉移，并可能作為轉移抑制基因，體內自發轉移試驗分析進一步證實了其抑制侵襲的功能，包括阻止胃癌的局部侵犯及抑制血液轉移［32］。

4.2 miRNA作用于胃癌侵襲轉移的機制 N-cadherin是一種增加侵襲潛能的鈣依賴性的細胞黏附分子［37］。在Gao等的這項研究中，熒光素酶測定和免疫印跡均顯示N-cadherin是miRNA145的直接靶基因，實驗還表明，當miRNA145表達細胞重新表達N-cadherin時，其入侵缺陷被逆轉，而使用miRNA145抑制劑抑制miRNA145的表達的細胞則導致N-cadherin的上調，當上調N-cadherin的基因被進一步沉默，細胞的遷移和入侵活動也受到相應的抑制［38］。還有研究發現，MMP9也同時參與胃癌的轉移，MMP9的增加可賦予胃癌細胞更大的穿透基質的能力，從而促進腫瘤侵襲［39］。Gao等通過觀察MMP9在轉染N-cadherin細胞和N-cadherin沉默細胞中的表達差異，推斷MMP9可能是miRNA145的下游靶基因，miRNA145通過作用于N-cadherin的表達間接下調MMP9，從而達到抑制胃癌細胞侵襲轉移的能力。

此外，Zheng等還發現miRNA145另外一個直接作用的靶基因Ets1。研究發現Ets1在胃癌組織高度表達，并且與胃癌細胞的入侵和轉移等惡性潛能相關，miRNA145通過在轉錄后水平直接作用于Ets1的3＇-UTR區域而抑制其表達，從而阻止了胃癌細胞的侵襲、轉移和血管生成［40］，Ets1進一步調節多個基因的表達，如MMP1、MMP9，u-PA，從而達成抑制細胞外基質重構、侵襲和轉移的目的［41］。

5 miRNA145與胃癌早期發現、治療及預后的關系

胃癌病因未明，臨床癥狀無特異性，確診需依賴胃鏡檢查加活檢，難以早期發現，但其預后卻直接與診斷時的分期相關。由于miRNA145在癌前病變組織中表達下降，且通過簡易的采血方式獲得的血清中含有用于檢測的足量的miRNAs，故其可作為早期診斷胃癌的生物學標志。

另外，腫瘤組織中miRNA145的表達量在很大程度上決定了放化療療效及預后。Homano等發現胃癌患者中miRNA145含量低者對順鉑化療容易耐藥，且術后總生存率降低，通過恢復miRNA145的功能可使耐藥細胞重新對順鉑敏感［42］，同時Takeshi Takagi等研究還發現通過轉染miRNA145也可以增加胃癌細胞對于5-氟尿嘧啶的敏感性［30］。

近期，Ibrahim等建立了一個miRNA替代療法，在活體小鼠結腸癌模型中運用聚乙烯亞胺(PEI)介導的工具載入miRNA145，全身和局部應用低分子量PEI/miR145復合物后，完整的miRNA145被運輸至小鼠腫瘤部位，引起了抗腫瘤效應。證實了miRNA145可以有效到達腫瘤部位發揮抑癌基因的作用，也預示著miRNA145基因替代治療胃癌的可實現性［43］。

6 展望

miRNA145作為胃癌抑癌基因的特征表明，它將成為胃癌治療中的新的突破點。相信在不久的將來，miRNA145可以更多地應用于幫助臨床醫師確定多種惡性腫瘤組織的起源、評價預后及指導治療，真正實現其臨床價值。

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