禽大腸桿菌型菌毛鑒定方法的初步研究

許 靜王 濤

1.江蘇省盱眙縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇盱眙 211700；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300

許 靜1王 濤2*

1.江蘇省盱眙縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇盱眙 211700；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300

禽大腸桿菌I型菌毛的表達(dá)和檢測(cè)在禽大腸桿菌的發(fā)病機(jī)理和流行病學(xué)研究中至關(guān)重要。本試驗(yàn)運(yùn)用麥康凱瓊脂平板從臨床樣品中分離鑒定了21株禽大腸桿菌，對(duì)這些菌株進(jìn)一步采用血凝/血凝抑制試驗(yàn)和PCR 2種方法檢測(cè)其I型菌毛。檢測(cè)結(jié)果顯示：血凝/血凝抑制試驗(yàn)對(duì)待檢菌株中I型菌毛的檢出率為85% （18/21），而運(yùn)用PCR方法的檢出率為90%（19/21）。表明運(yùn)用PCR方法檢測(cè)I型菌毛的檢出率比MSHA法更加敏感、快速，特異性強(qiáng)。

大腸桿菌；I型菌毛；甘露糖敏感血凝試驗(yàn)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；鑒定方法

禽大腸桿菌I型菌毛是禽源致病性大腸桿菌的相關(guān)毒力因子，在致病過(guò)程中介導(dǎo)細(xì)菌吸附于禽呼吸道黏膜上皮細(xì)胞，完成入侵的第一步，也是最重要的一步。禽大腸桿菌病的發(fā)生與菌毛的粘附作用有很大關(guān)系。一般認(rèn)為，菌毛可粘附于雞呼吸道的上皮，通過(guò)這種粘附，細(xì)菌得以定居，從而獲得侵襲的通道[1-3]。因此，禽大腸桿菌I型菌毛的表達(dá)與檢測(cè)，在禽大腸桿菌病的發(fā)病機(jī)理和流行病學(xué)研究中顯得至關(guān)重要[4]。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）樣品。從盱眙縣農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)健康家禽（其中雞5只、鴨5只、鵝2只）中無(wú)菌采集小腸腸道內(nèi)容物，經(jīng)麥康凱瓊脂平板分離培養(yǎng)。將經(jīng)麥康凱瓊脂平板分離到的大腸桿菌菌株分別命名為c1、c2、c3、c4、c5，d1、d2、d3、d4、d5，g1、g2。其它大腸桿菌菌株（分別命名為 1294，C600，C1214-77，O78F1+（5），A1，A2，A3，A4，B4）為揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物教研室提供，1294為人工構(gòu)建的表達(dá)I型菌毛操縱子全基因DH5α大腸桿菌，大腸桿菌C600、C1214-77、O78F1+（5）、A1、A2、A3、A4及B4為表達(dá)I型菌毛大腸桿菌致病菌株。

2）培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉10 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.2）。

3）主要試劑。PBS液，0.1%甘露糖-PBS液，1%豚鼠紅細(xì)胞，Taq DNA聚合酶，10×buffer（Mg2+），dNTPs，超純水，10×Loading buffer，DL2000（Marker），溴化乙錠，TAE電泳緩沖液。

1.2 病料的采集與分離

臨床上盡量無(wú)菌采集小腸腸道內(nèi)容物，經(jīng)麥康凱瓊脂平板分離培養(yǎng)。

1.3 純培養(yǎng)

將臨床分離的大腸桿菌挑取單個(gè)菌落劃線(xiàn)接種至LB平板，37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h。

1.4 血凝與血凝抑制試驗(yàn)

1）甘露糖敏感的血凝試驗(yàn)（MSHA）。將待檢菌株用0.05 mol/L PBS（pH 7.4）制備成細(xì)菌懸液，取細(xì)菌懸液與1%豚鼠紅細(xì)胞各一滴，滴在凝集反應(yīng)板上混勻，立即觀察。產(chǎn)生凝集判斷為陽(yáng)性，不凝集判斷為陰性。

2）抗甘露糖血凝試驗(yàn)（MRHA）。將待檢菌株用0.1%甘露糖-PBS制備成細(xì)菌懸液，取細(xì)菌懸液與1%豚鼠紅細(xì)胞各一滴，滴在凝集反應(yīng)板上混勻，立即觀察。產(chǎn)生凝集判斷為陽(yáng)性，不凝集判斷為陰性。

表1 大腸桿菌甘露糖敏感的血凝試驗(yàn)結(jié)果

表2 大腸桿菌抗甘露糖血凝試驗(yàn)結(jié)果

1.5 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）鑒定

1）引物的設(shè)計(jì)合成。根據(jù)GenBank已發(fā)表禽大腸桿菌I型菌毛FimH序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物如下，上游引物UpFimH：ATGAAACGAGTTATTACCCTGTT，下游引物 LoFimH：CGCCAATAATCGATTGCACATT；引物由上海基康生物技術(shù)有限公司合成。

2）模板DNA的制備。將細(xì)菌接種于3 mL的LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜；取1 mL培養(yǎng)后的菌液于1個(gè)指形管中，于離心機(jī)中以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心2 min，棄去上清液，取其沉淀；在沉淀中加入超純水1 mL，將沉淀懸浮；再次以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心2 min，同樣棄去上清取其沉淀；再加300 μL超純水，將沉淀懸浮；隔水煮沸6 min，使細(xì)菌裂解釋放出DNA；再離心，取其上清液于1個(gè)指形管中，作為DNA模板。

3）PCR擴(kuò)增體系。10×buffer（5 μL），dNTPs （1 μL），UpFimH（1 μL），LoFimH（1 μL），DNA模板（5 μL），超純水（36.5 μL），酶（0.5 μL）。

4）PCR程序。94℃預(yù)變性3 min；94℃1 min，53℃1 min，72℃1 min，共25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。

5）瓊脂糖凝膠電泳。21種樣品擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，EB染色，用凝膠成像系統(tǒng)照像，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘露糖敏感的血凝試驗(yàn)結(jié)果

將21株大腸桿菌菌株做甘露糖敏感的血凝試驗(yàn)，結(jié)果表明，21株菌株中18株為陽(yáng)性（其中16株為強(qiáng)陽(yáng)性），3株為陰性。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 抗甘露糖血凝試驗(yàn)結(jié)果

將21株大腸桿菌菌株做抗甘露糖血凝試驗(yàn)，結(jié)果全部為陰性。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果

2.4 不同檢測(cè)方法的結(jié)果比較

本試驗(yàn)用甘露糖敏感血凝試驗(yàn)/抗甘露糖血凝試驗(yàn)和PCR擴(kuò)增法對(duì)21株禽大腸桿菌進(jìn)行I型菌毛檢測(cè)，結(jié)果顯示：大多數(shù)禽大腸桿菌都產(chǎn)生I型菌毛。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3可以看出，MSHA/MRHA試驗(yàn)的陽(yáng)性檢出率為85%，而PCR方法的檢出率為90%。說(shuō)明在檢測(cè)方法上，PCR擴(kuò)增法比MSHA/MRHA法更加敏感、快速，特異性更強(qiáng)。

圖1基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖3基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖4基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

表3MSHA試驗(yàn)與PCR擴(kuò)增結(jié)果對(duì)比

3 討 論

目前，禽大腸桿菌I型菌毛的檢測(cè)常采用玻板O抗原凝集試驗(yàn)、免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、甘露糖敏感血凝試驗(yàn)等。其中，玻板O抗原凝集方法簡(jiǎn)易，無(wú)需特殊設(shè)備，但敏感度較低，尤其在菌液中非菌毛化細(xì)菌量過(guò)多或單因子血清效價(jià)不高時(shí)，易出現(xiàn)不完全凝集或假陰性，且結(jié)果判定具有主觀性，直接影響結(jié)果的判定；免疫熒光技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)都需要特殊的抗體標(biāo)記技術(shù)，但檢測(cè)方法繁瑣，且測(cè)得的抗體水平與疫苗保護(hù)力之間相關(guān)性較差；甘露糖敏感血凝試驗(yàn)方便 ﹑快速、較為準(zhǔn)確，但不敏感，有些無(wú)菌毛菌株可能因紅細(xì)胞非特異性凝集呈假陽(yáng)性[5]。

甘露糖敏感血凝試驗(yàn)是對(duì)I型菌毛表現(xiàn)型的檢測(cè)，而多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是對(duì)I型菌毛基因型的檢測(cè)。基因型檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的并不一定表現(xiàn)型檢測(cè)也為陽(yáng)性。本試驗(yàn)依據(jù)I型菌毛結(jié)構(gòu)基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，對(duì)待檢細(xì)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)進(jìn)行甘露糖敏感血凝試驗(yàn)對(duì)禽源致病性大腸桿菌I型菌毛進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：菌株c5MSHA結(jié)果為陰性，而PCR結(jié)果為陽(yáng)性。MSHA試驗(yàn)陽(yáng)性檢出率為85%，而PCR檢出率為90%。因?yàn)榇竽c桿菌即使有I型菌毛基因，由于培養(yǎng)條件等其他因素影響，不一定表達(dá)I型菌毛，所以導(dǎo)致甘露糖敏感血凝試驗(yàn)結(jié)果為陰性。這說(shuō)明MSHA試驗(yàn)不太敏感，檢出率低，而PCR方法更加準(zhǔn)確，更加方便，特異性更強(qiáng)。

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2014-05-05

*通訊作者

許 靜，男，1971年生，本科，獸醫(yī)師。