microRNA在癲癇調控中的作用研究進展

林青，劉素芝

（臺州醫院 神經內科，浙江 臺州 317000）

癲癇是一種由大腦神經元異常放電所引起的突然、短暫、反復發作的腦部功能失常的綜合征。癲癇病理機制十分復雜，包括神經細胞凋亡、神經膠質再生、炎癥反應等，其分子機制涉及基因轉錄、翻譯、翻譯后修飾等遺傳信息鏈中的多個環節。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內源性非編碼單鏈RNA分子，它們在動植物中參與細胞增殖和分化、凋亡、胚胎發育及疾病發生等一系列重要的生命過程。近年來研究表明miRNA與神經系統發育緊密相關，同時有研究顯示miRNA在癲癇發生、發展過程中起著重要的調控作用。現對miRNA在癲癇調控中的作用研究進展進行綜述。

1 miRNA的生成及作用機制

miRNA是一類進化上高度保守的單鏈非編碼小分子RNA，由21～25個核苷酸組成。miRNA在RNA聚合酶II作用下，由編碼miRNA的基因轉錄生成初級miRNA。初級miRNA隨后在RNA核酸內切酶Drosha和RNA綁定蛋白DiGeorge關鍵區域8（RNA binding protein DiGeorge critical region-8，DGCR8）作用下剪切成長度為60～70個堿基大小的帶有莖環結構的miRNA前體（precursor nliRNA，pre-miRNA），后者在轉運蛋白Exportin5作用下，從細胞核內運輸到細胞質中，經過Dicer酶識別后被剪切為成熟的雙鏈miRNA。之后該雙鏈RNA在解螺旋酶作用下生成成熟的miRNA和miRNA’，其中miRNA’被降解，miRNA則與相關蛋白形成RNA誘導的基因沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）結合而發揮生物學效應。miRNA通過與靶mRNA的3’非翻譯區（3’-untranslated regions，3’UTR）的堿基互補來識別靶基因，在轉錄或翻譯水平上調控基因的表達，實現對細胞增殖、凋亡、分化等過程的調節。在哺乳動物的大腦組織中發現了大量組織特異的miRNA。這表明miRNA在中樞神經系統有著重要的特定的作用[1-3]。

2 miRNA參與癲癇的調控作用機制

大量研究表明，癲癇的發生與神經細胞的凋亡、突觸聯系重建、神經膠質纖維細胞增生、異常通路形成以及炎癥反應密切相關[4-5]。反復的癲癇發作可導致大腦海馬神經元凋亡，形成異常興奮性突觸環路，最終促進難治性顳葉癲癇形成。可見miRNA可能是通過調控神經細胞的凋亡、突觸聯系重建、神經膠質纖維細胞增生、炎癥反應參與癲癇的發生發展。

2.1 miRNA參與調節癲癇介導的炎癥反應 研究表明腦內的炎癥過程是癲癇發作的一個重要機制。癲癇與炎癥相互促進，相互發展，癲癇發作引起炎癥，而炎癥可促進神經細胞興奮和癲癇發作。癲癇發生后會啟動一系列炎癥反應，導致炎癥遞質大量釋放，炎癥遞質一方面可引起血管炎，破壞血腦屏障，加重腦水腫及神經損害；另一方面，炎癥遞質可調節興奮性氨基酸的釋放和影響離子通道結構和表達，從而增高神經元細胞興奮性，進一步促進癲癇發作。所以，炎癥反應對于癲癇發作的持續存在起著重要作用[6]。miR-146a和miR-155可能通過介導炎癥反應參與癲癇的形成。

2.1.1 miR-146a：miR-146a作為一種調節Toll樣受體信號通路和細胞因子受體信號通路的內源性調節因子已經得到證實[7]。因此miR-146a和人類炎癥性疾病有密切關系。Vezzani等[8]發現嚙齒類動物癲癇模型的神經膠質內炎癥因子IL-lβ和TNF-α表達量明顯升高，IL-lβ是一種促炎細胞因子，可通過加強谷氨酸的神經傳遞，在癲癇后可通過對神經元直接作用或通過星形膠質細胞對神經元的間接作用參與癲癇形成過程，提示炎癥反應對癲癇的發生發展起重要的作用。Aronica等[9]在電刺激大鼠癲癇模型和癲癇患者研究發現癲癇發作后海馬組織的miR-146a各時點均表達升高，且主要在星形膠質細胞活化區域表達。因此推測miR-146a可能通過調節炎癥反應而調控癲癇的發生發展，但具體調節機制尚不清楚，可能與miR-146a降低NF-κB活性，抑制其靶基因IL-lβ表達有關。另外，Omran等[10]研究幼年大鼠的匹魯卡品顳葉癲癇模型和兒童顳葉內側癲癇（mesial temporal lobe epilepsy，MTLE）時發現大鼠海馬中IL-lβ在癲癇持續狀態（status epilepticus，SE）急性期時（SE后2 h）表達最高，此時miR-146a則處于低水平；在恢復期（SE后3周），IL-lβ則下降至最低峰，此時miR-146a表達則上升至最高峰，提示miR-146a對炎癥反應起負性調節作用。但在慢性期（SE后8周）IL-lβ逐漸升高，miR-146a逐漸下降，可能與急性炎癥控制，自發性癲癇發作有關。顳葉內側癲癇兒童海馬中IL-lβ和miR-146a均高于正常組。這些研究提示miR-146a在癲癇過程中扮演“抗炎”角色，因此，對其進一步研究人們可能找到新的癲癇治療策略。

2.1.2 miR-155：研究發現，miR-155也是一種炎癥相關性miRNA[12]，miR-155與炎癥因子TNF-α密切相關，兩者相互調節，共同介導炎癥反應。在內毒素小鼠休克模型中，miR-155過表達可增加TNF-α的表達，加重感染性休克[11]；在巨噬細胞炎性反應過程中，TNF-α可通過NF-κB和AP-1上調miR-155的表達，加重炎癥反應[12]。而TNF-α被證實可促進癲癇發作，給杏仁核點燃癲癇大鼠腹腔注射TNF-α可顯著延長癇性發作時間，可能的作用機制是TNF-α上調谷氨酸受體的表達[13]。這提示miR-155可能通過與TNF-α相互調節介導炎癥反應參與癲癇發作。在幼鼠癲癇模型、兒童顳葉內側癲癇患者、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和多藥耐藥相關蛋白8（Multi-drug resistance associated protein 8，MRP8）處理的星形膠質細胞中，Ashhab等[14]發現miR-155和TNF-α升高，推測兩者調節癲癇后炎癥反應，共同促進癲癇發生、發展。

2.2 miRNA通過細胞凋亡在癲癇發病中的作用 細胞凋亡是內部或外部信號誘導的程序性細胞死亡。DNA的損傷、低氧及葡萄糖的缺乏可以作為內部信號，介導內源途徑，引起線粒體功能障礙，導致多種促凋亡蛋白的釋放，近來研究表明細胞凋亡在癲癇發作過程中起著重要作用，癲癇發作后的部分神經元死亡通過細胞凋亡途徑來實現，這一過程由Bcl-2、Bax等凋亡相關基因控制，細胞凋亡使神經元數目減少導致神經元間突觸聯系的重組及腦功能失常，進而誘發癲癇發作及難治性癲癇形成。miR-21、miR-34a和miR-184可能參與癲癇后神經元細胞凋亡的基因調控機制。

2.2.1 miR-21：miR-21是一種凋亡相關因子，Chan等[15]發現在神經膠質母細胞瘤患者組織中miR-21表達增加，當抑制miR-21表達可使Caspase-3活性增加，瘤細胞凋亡增加，表明miR-2l表達與細胞凋亡有密切關系。張忱等[16]在氯化鋰匹魯卡品致癇大鼠模型研究中發現SE后24 h的大鼠海馬和外周血中miR-21的表達量下調，推測可能通過調控促凋亡基因而促進癲瘌持續狀態后神經元的凋亡。Risbud等[17]通過對癲癇大鼠海馬組織miRNA表達情況的研究，發現SE后48 h至3周大鼠海馬組織miR-21升高，而神經營養因子（neurotrophins-3，NT-3）下降；同時，培養的海馬神經元用KCl處理后，也發現miR-21升高，NT-3下降，然后他們應用生物信息學發現，miR-21對NT-3 mRNA3’UTR區具有抑制作用，提示癲癇后miR-21的升高與NT-3的降低有明顯的相關，而NT-3具有神經保護作用，癲癇后NT-3的降低可促進神經元凋亡[18]。Peng等[19]在幼鼠癲癇模型和兒童顳葉內側癲癇中也發現miR-21升高，并推測其通過下調NT-3表達發揮促凋亡作用。因此miR-21在癲癇后可能通過抑制NT-3表達發揮促凋亡作用。

2.2.2 miR-34a：miR-34最初是在秀麗隱桿線蟲發現的一個進化保守的miRNA家族，在脊椎動物中miR-34基因有三個成員（miR-34a，miR-34b，miR-34c）。miR-34a是P53基因的靶目標，P53上調miR-34a的表達，從而抑制下游因子MAP3K9、Bcl-2等的表達，誘導細胞凋亡[20]。Sano等[21]在紅藻氨酸（Kainate acid，KA）杏仁核致癇小鼠模型中發現癲癇后海馬中miR-34a升高，而Map3k9蛋白及P53的靶基因p21表達降低，在SE前沉默P53后miR-34a表達下降。他們還發現，在SE前用miR-34a特異性拮抗劑Ant-34a沉默miR-34a可使SE后miR-34a下降，并使促凋亡因子caspase-3下調，但卻未能減少海馬神經元凋亡，盡管miR-34a的下調未能減少神經元凋亡，但是其對p53依賴的凋亡通路中抗凋亡因子的上調可以反映出miR-34a的下調在分子水平上的抗凋亡趨勢。這一現象的發生可能與Ant-34a干預劑量不足有關，也可能與旁路代償有關；此外，Hu等[22]也在匹魯卡品致癇大鼠發現SE后miR-34a及caspase-3上調，Ant-34a下調miR-34a表達后，caspase-3表達下調，而Ant-34a下調miR-34a表達同時還減少SE后神經元凋亡。上述兩者實驗結果的差異可能由多方面原因造成：①實驗模型差異，前者為杏仁核注射紅藻氨酸誘導的邊緣葉發作癲癇小鼠模型，后者為氯化鋰-匹魯卡品誘導的顳葉癲癇大鼠模型，miR-34a在兩者模型中促凋亡作用的程度可能有差異。②取材時間不同，前者在SE后24 h取材，而后者在7 d后取材，兩者海馬內各種凋亡相關因子含量可能存在差異。③Ant-34a劑量差異，前者為0.5 nmol，而后者為1 nmol，對于抑制神經元凋亡，前者劑量可能不夠。上述的研究表明miR-34a表達升高可促使癲癇后海馬神經元凋亡。

2.2.3 miR-184：miR-184也是一種凋亡因子，研究發現在不同的腫瘤細胞中起的作用不同，在神經母細胞中miR-184過表達時可以引起瘤細胞的促凋亡效應[23]，而在舌鱗狀細胞癌中體外抑制miR-184水平，可誘導細胞凋亡，阻礙舌鱗狀細胞增殖，提示miR-184有抗凋亡作用[24]。Henshall等[25]研究紅藻酸致癇小鼠預處理模型發現海馬中miR-184表達升高3.26倍，其靶蛋白Akt顯著降低，而抑制miR-184后，海馬神經元凋亡顯著增加，提示miR-184在癲癇預處理模型中具有抗凋亡作用。其作用機制尚不明確，可能與調控Numblike，促進神經元增殖有關[26]；但也有研究發現miR-184通過下調Akt蛋白促進神經細胞凋亡[23]。所以miR-184在癲癇預處理模型中抗凋亡作用機制需要進一步研究。

2.3 miRNA參與調控癲癇突觸重塑 突觸是由神經元軸突和其他神經元的樹突或胞體形成的特殊結構，是神經元之間進行信息傳遞的樞紐。突觸接受細胞外信號，引發其結構和功能的改變，包括樹突的重塑、突觸的形成、長時程增強（long-term potentiation，LTP）/長時程抑制（long-term depression，LTD）發生等，稱為神經元可塑性。目前研究證實，在癲癇發作后，腦內神經元之間出現異常突觸聯系，形成病理性神經環路，這就是突觸重塑，以苔蘚纖維出芽為主要形式，突觸重塑使癲癇反復發作，導致難治性癲癇[4]。因此，突觸重塑的研究對于癲癇的發病機制及難治性癲癇治療的探索具有重要意義。miRNA-134、miRNA-132、miRNA-124可能通過突觸重塑機制參與癲癇發生發展。

2.3.1 miRNA-134：Schratt等[27]研究發現miR-134可調節樹突棘的數量。miR-134靶基因是編碼LIM區域激酶l（LIM-domain kinase 1，Limk1）的mRNA。miR-134能夠通過抑制Limkl表達對海馬神經元樹突棘大小進行負調控。miR-134過表達后，樹突棘變小。其機制可能為miR-134抑制Limkl的mRNA翻譯，從而影響肌動蛋白解聚因子，調控肌動蛋白絲的動態平衡，最終影響樹突棘的形態。而腦源性神經營養因子（brain derived neurophicfactor，BDNF）可以解除miR-134對Limkl的抑制，誘導樹突棘生長、成熟和可塑性。miR-134因此調控樹突棘大小和數量，在突觸重塑中起重要調節作用。Jimenez-Mateos等[28]在KA小鼠顳葉癲癇模型及人類顳葉癲癇患者研究發現海馬內miR-134升高，Limk1降低。用miR-134特異性拮抗劑ant-134沉默miR-134后發現，海馬內Limk1水平恢復，神經元棘突密度顯著降低，同時產生顯著的抗癲癇及神經保護作用。他們又用細胞實驗證實ant-134這一作用是通過恢復Limk1水平來實現。miRNA-134的上調也同樣發生在幼鼠癲癇模型和兒童顳葉內側癲癇中[19]。因此推測miRNA-134通過突觸重塑在癲癇的發生發展中起著重要調節作用，而ant-134可抑制癲癇突觸重塑的發生，具有抗癲癇及神經保護作用。

2.3.2 miRNA-132：miRNA-132也是樹突棘調控因子，與突觸重塑密切相關。研究發現miRNA-132能在BDNF誘導下，經cAMP效應元件結合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）調控轉錄，抑制Rho家族的GTP酶激活蛋白（p250GAP）的合成，從而誘導活性-海馬神經元樹突分支及樹突棘的生長。miR-132導入海馬神經元可誘導突觸的發生，而通過拮抗劑抑制miR-132表達則阻止了突觸的發生。表明miRNA-132在神經元結構和功能可塑性調控過程中具有重要作用[29]。Scott等[30]發現大鼠邊緣區皮質中miR-132過表達可引起短期記憶功能損害且可抑制邊緣區皮質神經元LTP，這說明miR-132調控突觸可塑性影響認知功能。Nudelman等[31]在匹魯卡品癲癇小鼠模型中研究發現，致癇小鼠海馬中miR-132升高，推測其可能參與癲癇后的突觸重塑過程。而Jimenez-Mateos等[32]則發現沉默miR-132可減少癲癇小鼠神經元凋亡，這一神經保護作用可能通過p250GAP樹突棘的調控來實現。此外，miRNA-132的上調也同樣發生在幼鼠癲癇模型和兒童顳葉內側癲癇中[19]。

2.3.3 miRNA-124：miR-124是腦內最豐富的一種miRNA，提示其在神經系統中可能發揮重要調節作用。研究發現miR-124可促進軸突生長，阻斷其表達則抑制軸突生長并降低α-微管蛋白的表達[33]，說明miR-124參與神經細胞骨架結構、軸突生長的調節。Yang等[34]研究發現，EPAC基因無效突變小鼠的神經元突觸傳遞和LTP功能異常，空間學習和社交能力降低，而敲除miR-124能逆轉上述變化，恢復認知功能，表明miR-124參與突觸長時程可塑性的調節而影響認知功能。這些研究結果表明miR-124與神經元突觸重塑密切相關。在幼鼠癲癇模型和兒童顳葉內側癲癇患者海馬的研究中，Peng等[19]發現miR-124的表達上調，推測其可能參與癲癇后的突觸重塑過程并因此進一步影響癲癇后的認知功能。

3 展望

mRNA調控著生物體的基因表達，參與人體的生理、病理以及生化反應調節。miRNA在癲癇的發生發展過程中扮演著重要角色，miRNA將有可能成為癲癇的新的診斷和治療的靶點，但是由于miRNA及其靶基因調控網絡的復雜，目前對于以miRNA為潛在靶點對癲癇進行診斷和治療尚缺乏理論依據，需要進一步探討。首先，miRNA影響癲癇病因的分子機制還有待更進一步的闡明，從而找到相對應的治療靶點；其次，miRNA對癲癇的診斷價值如何，是否能夠找到預測癲癇發生及造成腦損害生物學標記物，將為癲癇提供一種新的診斷策略；最后，探索基于內源性miRNA作用新技術平臺并進行分子藥物設計，找到合適的藥物載體，開發新型即通過血腦屏障又具有較高的轉染效率和較小的不良反應藥物。綜上所述，miRNA在臨床診療癲癇方面的應用仍需要不斷研究、探索、嘗試，最終才能實現。目前雖然miRNA參與癲癇的調控作用機制的研究仍處于起步階段，但是隨著研究的不斷深入，miRNA對癲癇的病理機制的深入揭示及癲癇臨床診療的進步可能會起著巨大的促進作用。

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