中醫院校醫學微生物實驗菌種管理心得

張穎穎，車 萍

（山東中醫藥大學，山東 濟南 250014）

在中醫院校，醫學微生物學是一門重要的基礎課程。該課程實驗性強，實驗學時較多。而菌種管理是一項基礎工作，包括菌種的購買、活化、分離、保藏等環節，決定著醫學微生物實驗的成功與否。微生物實驗室必須保證實驗用菌種具有較高的純度，穩定的生理生化特性，保證菌種在使用中不出現退化、死亡等現象，否則就會影響實驗結果[1]。因此，需要制定嚴格的菌種使用管理規定，針對不同實驗要求，選擇合適的菌種，因地制宜采取最合適的菌種純化保藏方法。筆者結合實驗準備經驗，就中醫院校醫學微生物實驗菌種管理工作談一下心得體會。

1 中醫院校醫學微生物實驗常用菌種及其用途

中醫院校醫學微生物課程相對西醫院校而言比較簡煉，學時少，但教學內容覆蓋面較廣，還要與中醫相結合，因此，其教學側重中藥抑菌、中醫藥抗病毒等方面。具體到菌種的選擇上，革蘭氏陽性細菌有金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、A群鏈球菌、枯草芽胞桿菌、肺炎鏈球菌、破傷風梭菌、結核分枝桿菌、藤黃微球菌等；革蘭氏陰性細菌有大腸埃希菌、志賀菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、傷寒沙門菌、肖氏副傷寒沙門菌、變形桿菌、產氣桿菌、霍亂弧菌等；真菌如白色假絲酵母等。以上菌種可用于細菌的各種染色法、接種法練習，觀察各種微生物形態，進行中藥抑菌實驗等。

2 中醫院校醫學微生物實驗菌種來源

2.1 直接采購

2.1.1 國內采購 目前國內各大菌種保藏機構均提供菌種采購服務，可按照其網站介紹進行購買，往往以安瓶等形式提供菌種。國內幾大菌種保藏機構，如中國普通微生物菌種保藏管理中心、中國微生物菌保藏管理委員會普通微生物中心、中國工業微生物菌種保藏管理中心等，均出售菌種；另有各生物公司均提供進口與國產菌種服務；一般省級防疫中心也提供菌種服務。

2.1.2 國外采購 國外方面，如ATCC（American Type Culture Collection，美國典型菌種保藏中心）、NBRC（NITE Biological Resource Center，日本技術評價研究所生物資源中心）、DSMZ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，德國微生物菌種保藏中心）、CBS（Centraalbureauvoor Schimmelcul-tures，荷蘭微生物菌種保藏中心）等都提供菌種服務，但其缺點在于價格昂貴、郵寄繁瑣、耗時較長，因此不適用于學生實驗。

2.2 自行分離

訂購標準菌種簡單方便，但也存在價格較高、程序繁瑣等問題，如ATCC菌種價格通常為800元以上，國內菌種亦不低于200元。再者，若進行臨床相關微生物研究，就必須準備臨床分離菌種。因此，在微生物實驗中，自行分離也是菌種的重要來源之一。如可從空氣中分離葡萄球菌、藤黃微球菌，自口腔分離白色假絲酵母，從腸道中分離大腸埃希菌及其他腸桿菌等。在教學中，我們結合SRT（大學生研究訓練）項目等學生活動，從環境中分離了藤黃微球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌等常見菌種，既可用于實驗教學，也可培養學生的動手能力。

2.3 從醫院獲得臨床菌株

中醫院校通常與相關醫院有密切聯系。臨床病患體內外分離的菌株具有典型的致病性，便于結合臨床進行教學，故此亦可成為菌種的重要來源之一。我校微生物教研室現有幾十株從臨床分離的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌（含MRSA等耐藥菌株）、銅綠假單胞菌、痢疾志賀菌、福氏志賀菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌等臨床菌株。但該法獲得的菌株一般毒性較強，通常僅限于科研應用，在實驗教學中使用時需注意生物安全，保存條件應符合相關規定。

2.4 致函索要

可在網絡上檢索相關文章，通過致函菌種擁有者索要菌株。國外眾多科研機構可免費分享自己的菌種，有些需要簽署保密協議，不得用于商業用途等。該法多用于科研。

3 實驗菌種的復活、傳代、純化工作

3.1 外購菌種

若采用外購菌種，復活和傳代是必備的基本操作?？梢詫⑦m量液體培養基滴入安瓿瓶中，溶解菌種并接種于對應培養基上，在適宜條件下進行培養，經形態學、生化反應等鑒定為純種后方可投入實驗應用。在此過程中必須保證菌種的純度及性狀穩定，如發現污染或菌種不純，則應通過劃線分離操作將其進一步純化，重新分離挑選純菌落[2]。

3.2 自行分離菌種

自行分離菌種時，復活步驟無需考慮，重在菌種的鑒定、純化、傳代和保藏。其中鑒定工作可查閱相關資料，如《伯杰氏細菌手冊》等權威工具書，根據形態學特征、生化反應及免疫學檢驗等確定菌株，并通過選擇培養基和劃線分離等手段進行純化。各項指標均應符合規定，以保證菌株鑒定的準確性。

4 實驗菌種常用保藏方法

由于條件所限，中醫院校在實驗設備上往往與西醫院校有一定差距，因此，如何針對實際情況采取合適的菌種保藏方法，也是需要重點思考的問題。常用菌種保藏方法有6類，分別是定期移植保藏法、液體石蠟覆蓋保藏法、試管熔封保藏法（試管密封法）、干燥法、冷凍真空干燥法和液氮超低溫保藏法。在此，筆者結合實際條件，在充分查閱文獻的基礎上選取了幾種常用且簡單易行的保藏法，并做了適當改進，收到了較好效果，現介紹如下。

4.1 定期移植保藏法

學生實驗中大量使用的菌種一般使用該法保藏。具體操作為斜面低溫保藏，即以無菌操作將菌種轉種于新鮮培養基斜面上，經鑒定菌種純度及生理生化性狀符合要求后置于4～6℃冰箱中低溫保存。此法適用于要求不高，但菌種需求量較大的革蘭氏染色、細菌接種、藥物敏感實驗等。

4.2 液體石蠟覆蓋保藏法

該法是一種改良的傳代培養方法，通常將菌種接種于適宜的培養基上，取培養后生長良好的斜面，加入無菌石蠟油沒過培養基最上端約1 cm，包裹牛皮紙后將其放置于4℃冰箱低溫保存。外購菌種經該法轉種保藏后可保證1～2年內菌種性狀不變。因此，該法適用于普通微生物實驗室菌種保藏。近年來我校購進菌種部分為試管斜面保存，故我們在實踐中廣泛采用該法對菌種進行保存，收到了較好效果，可保證1年內菌種的性狀穩定。

4.3 動物組織保藏法

王丹敏[3]等用含菌鼠肝保存肺炎鏈球菌取得成功。因此可用含菌動物組織于-20℃環境下進行菌種保存，其保藏時間可達18～20個月。經實踐驗證，該法對某些抵抗力較弱的致病性細菌有效。

5 總結

做好醫學微生物實驗菌種管理工作，必須制定嚴格的操作程序，完善相關制度，實施規范操作，不斷總結經驗以提高管理水平。

5.1 嚴格菌種管理制度，盡可能購買高質量菌種

國內外各機構、公司均可提供菌種服務，但質量不盡相同。如ATCC標準菌種雖價格較貴，但質量穩定，用于要求較高的科研實驗較為合適；國標CMCC菌株經濟性較好，質量也有保證，亦是較好的選擇；也有個別公司提供的菌種存在污染等現象，筆者在工作中曾遇到此類情況，后通過分離純化保證了實驗的正常進行。科研工作中如需臨床分離的非標準菌種，則可向國外同行致函索要，往往能得到滿意的結果。

5.2 注重生物安全，做好高致病性菌種保管工作

醫學微生物實驗對操作要求較高，要求實驗室建立完整嚴格的管理規范，做好菌種管理工作。由專人負責，使用時嚴格無菌操作，防止菌種污染。此外還要按照正確的方法進行菌種傳代保藏，以免菌種退化。

5.3 從實際出發，根據實驗室條件制定合適的保藏策略

菌種保藏方法多樣，對實驗條件要求各不相同，通常越復雜的方法保藏效果越好。本文所述之法均簡單易行，一般條件的微生物實驗室均能滿足，且經實踐證明完全能滿足中醫院校醫學微生物學教學要求。如需進行深入研究，則可視情況采用較為復雜的保藏法。

總之，在中醫院校，完善的菌種管理是醫學微生物學教學科研工作順利開展的前提。微生物實驗室應盡可能做好菌種庫建設工作，既要有常用標準菌株，也應收集部分臨床菌株，保證滿足教學科研需求。這就要求我們在工作中注重菌種收集，因地制宜采用最合適的保藏法，注重經濟性與實用性的結合，有效提高菌種的使用效率。同時，近年來生物安全的重要性日益凸顯，為保證菌種的安全使用，必須建立健全管理制度，嚴格消毒滅菌程序，防止出現安全事故。