MTHFR基因多態性、Hcy、B12、葉酸與胚胎停止發育的相關性

蔡麗梅，朱珍珍，虞如芬

MTHFR基因多態性、Hcy、B12、葉酸與胚胎停止發育的相關性

蔡麗梅，朱珍珍，虞如芬

目的探討MTHFR基因多態性、血清同型半胱氨酸（Hcy）、維生素B12及葉酸與胚胎停止發育的相關性。方法選擇胚胎停止發育孕婦（胚胎停止組）76例，正常孕婦(正常胚胎組)50例，同齡育齡期婦女（正常育齡組）50例，抽空腹靜脈血10m l，苯酚/氯仿法提基因組DNA，PCR擴增、聚合酶反應檢測其基因類型，采用雙試劑循環酶法測定血漿總Hcy水平，微粒子酶免分析法測定血漿葉酸、維生素B12水平；觀察比較3組和各基因類型頻率、Hcy、、B12、葉酸值，并進行統計分析。結果胚胎停止組TT基因型和T等位基因所占比率均明顯高于正常胚胎組（均＜0.05），CT、CC基因型、C等位基因明顯小于正常胚胎組（均＜0.05）；兩組內各基因型Hcy值比較均為TT＞TC＞CC（均＜0.05），B12、葉酸值比較均為TT＜TC＜CC（均＜0.05）；兩組間TT、TC的Hcy值比較均為胚胎停止組〉正常胚胎組（均＜0.05），B12、葉酸值比較均為胚胎停止組＜正常胚胎組（均＜0.05），兩組CC基因型間Hcy、B12、葉酸值比較差異均無統計學意義（＞0.05）。結論MTHFR基因表現為多態性，胚胎停止發育可能與TT基因突變、血清Hcy升高、B12和葉酸值下降有關。

胚胎；停止發育；MTHFR基因；多態性；血清同型半胱氨酸

胚胎停止發育是指妊娠早期因某種原因所致胚胎停止發育，即妊娠早期(受精5周或妊娠7周)后見胚芽而無原始心管搏動，孕囊枯萎或B超圖像僅見孕囊而未見胚芽[1]。胚胎停止發育有逐年上升的趨勢，它的發生機制十分復雜，除感染、子宮畸形、內分泌異常及染色體異常等因素外，還有60%～70%的原因不明[2]。筆者收集了胚胎停止發育孕婦（胚胎停止組）76例，正常孕婦(正常孕婦組) 50例對MTHFR基因類型及各基因類型的血清同型半胱氨酸（Hcy）、維生素B12、葉酸值，分析MTHFR基因多態性、Hcy、B12、葉酸與胚胎停止發育的相關性，現總結報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象收集2012年6月至2013年6月在溫州醫科大學附屬第三醫院就診的孕婦胚胎停止發育孕婦（胚胎停止組）76例，正常同期孕周孕婦（正常胚胎組）50例。胚胎停止組年齡24～34歲，平均（28.5±2.7）歲；產次1～2次，平均（1.3±0.2）次；孕周7～11周，平均（8.7±1.3）周。正常胚胎組年齡24～34歲，平均（28.3±2.6）歲；產次1～2次，平均（1.3±0.1）次；孕周7～11周，平均（8.6±1.2）周。兩組一般資料差異均無統計學意義（均＞0.05）。所有入選患者均簽置入選知情同意書。

1.2 胚胎停止發育和正常妊娠診斷標準（1）胚胎停止發育：頭臀長度≥7 mm且無心跳；孕囊平均直徑≥25mm且無胚胎；無卵黃囊的孕囊2周后不見有心跳的胚胎；有卵黃囊的孕囊11 d后無心跳。（2）正常早孕：月經停止，人絨毛膜促性腺激素（HCG）升高，超聲下見妊娠囊內胚芽和胎心搏動。排除標準：隨訪過程中出現胚胎停止發育者出現流產；高血壓、內分泌疾病、急性感染和其他重要臟器疾病。

1.3 方法

1.3.1 超聲檢查飛利浦HDI5000B超機，探頭頻率3.5MHz，取平臥位，行縱、橫、斜向掃查監測胚胎，觀察胚胎心血管搏動及孕囊的大小。

1.3.2 Hcy、葉酸、B12檢測抽取空腹靜脈血液3m l，高速離心取血清；用Abbott公司生產的IMX型自動生化分析儀、配套Hcy試劑盒、雙試劑循環酶法檢測Hcy水平(正常值為5～15mmol/L)，用微粒子酶免分析法測定血漿葉酸、B12水平。

1.3.3 MTHFR基因型檢測（1）DNA提取：用含細胞保存液的真空管采血3m l，用轉速為10 000 r/min的高速離心機離心10 m in，棄上清液，用苯酚/氯仿法提基因DNA，試劑盒由Gibco公司提供。（2）MTHFR基因PCR擴增：用美國ABI公司生產的PE9600型PCR DNA熱循環儀擴增儀，劑盒有香港凱善公司提供；引物序列：5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3’，5’-GGACGGTCCGGTGAGAGTG-3’；反應體系：總體積25 L，其中ddH2O 18.5 l，10×緩沖液2.5 l，10mM的dNTPs 1 l，12.5 pmol/l的引物各1 l，DNA 1 l。反應條件：95℃預變性5min，溫度95℃30 s，62℃45 s，72℃50 s，10m in，共30個循環后72℃再延伸10 min，4℃保存，配制2%瓊脂糖凝膠(含0.5m l溴化乙錠)。擴增結果觀察：取擴增產物5 l，加10 l dd H2O及2 l溴酚蘭，混合后電泳(電壓

110 V，30m in)，在紫外燈下觀察擴增片段大小198 bp，證實擴增成功。(3)酶切反應：擴增產物中加入限制性內切酶HinfⅠ酶切反應體系20 l，該體系包括擴增產物5 l、10倍緩沖液2 l、Hinfl10 l、ddH2O12 l。37℃消化24h，將酶切產物進行電泳30m in。（4）MTHFR基因分型判讀：取酶解產物12%聚丙烯酰胺凝膠電泳3 h，以溴化乙錠染色，紫外燈下觀察、攝片。

1.4 統計方法用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，計量資料采用均數±標準差表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-檢驗；；兩組比較采用檢驗。＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTHFR基因PCT-RFLP電泳結果CC野生型只有198 bp片段，CT雜合性有198 bp、175 bp、23 bp3條片段，TT純合突變型有175 bp、23 bp2條片段，2%瓊脂糖凝膠電泳后23 bp片段游出，見圖1。

2.2 胚胎停止組和正常胚胎組MTHFR基因型頻率比較胚胎停止組TT基因型、T等位基因所占比率明顯多于正常胚胎組（均P＜0.01），CT、CC基因型和C等位基因明顯小于正常胚胎組（均＜0.01）。見表1。

2.3 兩組不同MTHFR基因型孕婦血清Hcy、B12、葉酸值比較兩組內3種基因型的Hcy值比較，TT＞TC＞CC，差異有統計學意義(均＜0.05)；B12、葉酸值TT＜TC＜CC，差異有統計學意義(＜0.05)。兩組間同基因型，TT、TC基因型Hcy值胚胎停止組＞正常胚胎組（9.20、6.68，均＜0.05），B12、葉酸值比較胚胎停止組＜正常胚胎組（=2.82，＜0.05）；兩組間CC基因型Hcy、B12、葉酸值差異無統計學意義(≤0.28，均＞0.05)。見表2。

3 討論

3.1 胚胎停止孕婦和正常孕婦MTHFR基因多態性分析MTHFR是一種黃素蛋白，MTHFR基因定位在1號染色體，基因全長2 220 bp，包含有11個外顯子和10個內含子[3]。MTHFR基因多態性位點存在兩種等位基因，即野生型C與突變型T，組合為3種基因型：TT、CT和CC。唐儀等[4]認為MTHFR基因多態性發現CT/TT基因型人群患原發性高血壓病(EH)的危險性比CC基因型人群高。鄭苗苗等[5]對急性淋巴細胞白血病患兒MTHFR基因多態性檢測結果發現C677T位點：CC野生型27例(52%)，CT雜合型l6例(31%)，TT純合型9例(17%)。國內外多項關于MTHFR基因個型分布頻率研究結果存在差異的可能原因包括：種族之間等位基因頻率的差異、基礎疾病、葉酸營養狀況、飲食或同時服用的藥物等環境因素[6]。本組資料顯示胚胎停止組TT基因型和T等位基因所占的比率明顯高于正常胚胎組（＜0.05）；CT、CC基因型、C等位基因所占比率明顯小于正常胚胎組（＜0.05）因此，筆者認為MTHFR基因多表現為態性，TT基因突變與胚胎停止發育可能存在相關性。

3.2 MTHFR基因多態性、Hcy、B12、葉酸值與胚胎停止發育的關系MTHFR基因有兩個不同的等位基因(C和T)，T是與酶的活性下降和同型半胱氨酸血癥的風險增加相關[7]。兩組組內各基因型Hcy值比較均為TT＞TC＞CC（＜0.05），兩組間TT、TC基因型同基因型的Hcy值比較均為胚胎停止組〉正常胚胎組（＜0.05）。兩組CC基因型Hcy值比較無顯著差異（＞0.05）。由此可見不同MTHFR基因型孕婦其血清同型半胱氨酸值不同，TT基因胚胎停止發育孕婦的其血清同型半胱胺酸值較高，CC基因型者血清同型半胱氨酸值相對較穩定。因此，胚胎停止發育TT基因突變者血清Hcy值相對較高。Hcy多個方面影響血液的凝固性，如改變內皮細胞抗血栓能力、增加纖維蛋白的形成及抑制纖溶酶的活性等從而提高血液的凝固性，降低纖溶性，促進血栓形成[8]。Hcy的生理代謝處于再甲基化作用和轉硫化作用這兩個代謝途徑的交叉點，當血液中Hcy濃度升高，可以造成人體血管堵塞、血管內皮損傷，甚至血壓增高[9]。另外統計發現兩組內各基因型B12、葉酸值比較均為TT＜TC＜CC（＜0.05）；兩組間TT、TC的B12、葉酸值比較均為胚胎停止組〈正常胚胎組（＜0.05）；兩組CC基因型間B12、葉酸值比較均無顯著差異（＞0.05）。由此可見胚胎停止發育者TT基因者血清B12、葉酸值相對較低，CC基因型者血清B12、葉酸值較TT、TC型穩定。血漿中Hcy濃度與遺傳因素及飲食因素有關，如果葉酸、維生素B12攝入不足，甲基化轉移障礙，Hcy再不能生成蛋氨酸，可導致血漿Hcy蓄積[10]。MTHFR活性降低使半胱氨酸合

成甲硫半胱氨酸減少，最終血Hcy濃度增加[11]。總之，THFR基因的多態性、血清Hcy、B12和葉酸值相互影響，MTHFR基因TT突變、血清Hcy值升高、B12和葉酸值的降低都會影響胚胎的正常發育，相互之間可能存在明顯的相關性。

表1 胚胎停止組和正常胚胎組MTHFR基因型頻率比較例（%）

表2 兩組不同MTHFR基因型孕婦血清Hcy、B12、葉酸值比較

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10.3969/j.issn.1671-0800.2014.05.054

R714.7

A

1671-0800(2014)05-0602-03

溫州市科技局科技項目（Y20120288）

325200浙江省溫州，溫州醫科大學第三醫院（蔡麗梅、虞如芬）；瑞安市中醫院（朱珍珍）

蔡麗梅，Email：23747069 09@qq.com。