梅毒螺旋體分子流行病學研究進展*

曾 丹 綜述,周維康 審校

(重慶市第三人民醫院過敏反應科 400014)

梅毒是由蒼白螺旋體(treponema pallidum，TP)引起的慢性傳染病，主要通過性交傳染。近年來，世界各地梅毒發病率呈上升趨勢，我國梅毒發患者數也快速增長，據報道，2010年全國報告梅毒病例358 534例，2010年發病率26.86/10萬，比2009年增加17.02%，居全國乙類傳染病的第3位。本病危害大，可侵犯皮膚黏膜、心血管、神經、骨骼等造成多系統損害,也可使妊娠期婦女發生流產、死胎和分娩先天梅毒兒。在性傳播疾病中，梅毒致死性僅次于艾滋病，其與艾滋病的傳播途徑相似，同時，梅毒作為一種潰瘍性性病，可大大增加感染HIV的風險，有報道稱生殖器潰瘍患者較健康人感染HIV的危險性增加4～5倍[1]，因此，梅毒的流行在客觀上促進了HIV的傳播，控制梅毒等相關的生殖器潰瘍疾病，能有效控制HIV的傳播和艾滋病的發生。目前，國內外學者也越來越重視梅毒螺旋體的研究。梅毒螺旋體分子亞型研究不僅與梅毒流行病學緊密相關，也可用于識別和分析梅毒的再感染。TP不能根據血清學方法進行區分，有學者曾通過DNA雜交及單核苷酸多態性等進行分型，未成功[2-3]。自從Fraser等[4]揭示了TP的基因序列后，有關TP的研究進入了分子生物學時代。

1 TP基因分型系統

1.1arp、tprEGJ雙基因分型法(CDC分型系統) 最早進行TP基因分型研究的是美國CDC的Pillay等[5]，其于1998年《Sex Transm Dis》中報道了一種分型方法，選用兩種顯示株內變異的基因：酸性重復蛋白基因arp和TP重復序列tpr Ⅱ亞類(EGJ)作為分型基因，建立了TP基因的分型方法。將arp基因含有的60 bp(堿基對長度)相似重復序列的數目和tpr基因Mse1限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorohism,RFLP)的類型相結合。首先對arp基因進行普通PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，將得到的目的片段換算成60 bp重復序列的數目，并用相應的阿拉伯數字表示。目前已發現arp含有2～22個60 bp重復基因序列，共21個亞型。Harper 等[6]的分子流行病學研究結果顯示在不同的人群、不同的臨床病程中,該重復序列的出現次數均存在顯著性差異。同時tpr基因進行套式PCR擴增，產物先后經Mse1限制性酶切和瓊脂糖凝膠電泳分離，最后產生不同電泳條帶的樣式即為RFLP類型，依次用英文字母表示。根據不同株出現長度不等的限制性內切酶的酶切片段，已發現tpr基因A-L共12個亞型。最后將兩個結果相結合即為TP基因型別,例如TP Nichols株屬于14a亞型。通過兔傳代并經組織培養的TP Nichols株進行驗證的結果和采用Simpson多樣性指數分析的結果均顯示，該分型方法具有結果穩定、分辨率高和可重復性好的特點，容易操作，而且對TP株有很高的鑒別力，符合一般微生物分型系統的評判標準。

1.2arp、tpr/tp0548三基因分型法 最近，Marra等[7]在上述分型系統的基礎上引入了tp0548基因，進一步提高了基因分析的區分能力。同樣的，是將arp基因含有的60 bp相似重復序列的數目和tpr基因Mse1 RFLP的類型相結合，再加上tp0548的基因分析。研究發現，從起始密碼子起，部分基因131 bp的下游側有變異，觀察到tp0548基因有9個不同的序列組，這些序列組用小寫英文字母a-i表示。將改進了的分型系統表示為“CDC subtype/tp0548 sequence type”，例如：14d/f。這種分型系統被描述為“改良梅毒螺旋體菌株分型系統”，在接下來的研究中發現了這種分型系統具有生物學與臨床學的關聯性。通過對TP Nichols株與原始株的無性繁殖，然后進行分型比較，結果二者的分型一致(14a/a)，提示該分型具有穩定性的特點。國內學者彭銳銳等[8]運用了三基因定位分型方法檢測梅毒螺旋體基因型別的敏感性與特異性，分析arp基因60個堿基對重復序列的數目、tprEGJ基因MseI酶切后限制性片段長度多態性的型別和tp0548基因序列的型別，根據上述三基因的分析結果，分析梅毒螺旋體基因型別。結果發現，臨床標本中三個基因的擴增敏感性分別是94.1%、91.2%和94.1%；91.2%的臨床標本檢測出完整的基因型別，與二基因分型法相比，提高了6.2%的區分度?？梢哉J為，改良的三基因分型方法檢測梅毒螺旋體基因型別具有敏感性高、特異性好、區分度強的特點。

2 梅毒螺旋體基因分型的臨床應用

2.1基因分型標本的選取 目前用于分型的標本主要考慮梅毒螺旋體的量，主要來源于早期梅毒的侵潤性皮損，且主要是潰瘍性皮損，也有腦脊液和全血。Martin等[9]認為，應用PCR技術檢測一期梅毒患者體內梅毒螺旋體DNA最適合的標本是生殖器潰瘍分泌物。一些研究者發現以血清為標本，陽性率高，另外有報道以血漿為樣本，陽性率高[10-11]，而Orton等[12]稱在全血中未能檢測到梅毒螺旋體。Molepo等[13]在對梅毒患者腦脊液(CSF)標本進行分型分析時發現,性病研究實驗室(VDRL)陽性的CSF標本,可能有足夠的DNA以供分型研究，因為在所有可分型的標本中，僅一份標本其VDRL試驗的IgG結果陰性，其余均為陽性。Castro等[11，14]研究發現耳垂血用于PCR檢測的效率高于全血、血漿和血清,其原因可能是TP與包柔氏螺旋體相似,多隱藏于毛細血管床比較豐富的耳垂部。還有最近的一項研究，Wu等[15]發現，TP DNA分離率最高的是潰瘍分泌物，接下來依次是血漿、血清、腦脊液和玻璃體液。這些實驗結果的差異可能是由于梅毒螺旋體DNA提取方法、PCR檢測技術以及臨床樣品的質量和梅毒螺旋體含量等一些不避免的因素造成。另外，其他臨床樣本也可用于梅毒螺旋體的PCR技術檢測，如二期梅毒疹滲出物、淋巴結穿刺液、羊水、組織抽吸物、石蠟包埋組織、精液、外周血單核細胞、胃黏膜組織、樹膠腫等。

2.2梅毒螺旋體基因分型用于流行病學調查

2.2.1arp、tpr雙基因分型法(CDC分型系統)的應用 梅毒螺旋體的arp基因和tpr基因的聯合分型目前主要用于梅毒分子流行病學調查。Pillay等[5]首次應用這種分型方法,將在美國、馬達加斯加和南非收集的46例樣本分16個亞型,其中馬達加斯加收集的21個樣本有12個屬于14d亞型,美國收集的13個樣本只有3個屬于14d亞型,從這可以反映出14d亞型在馬達加斯加廣泛流行。另有研究發現南非各地區的161例樣本可分35個亞型,優勢流行菌株亦14d亞型，研究人員推測,菌株高度的變異性可能是梅毒在南非長期流行的結果[16]。而在亞利桑那州、卡羅來納州和美國北部,14F亞型是主要的流行株[16]。南非比勒陀利亞[13],研究者們從來源于晚期神經梅毒患者的標本中，確定了4種不同類型，分別是14A、2I、3E、17E，14A亞型是比勒陀利亞神經梅毒最主要的流行株,接下來為3E，并檢出少見的亞型(2I和 17E),其中2I、3E、17E是在那之前的研究中所沒有的，tpr中的e和i限制性片段長度多態性(RFLP)曾經報道過，但只有兩個或三個60 bp重復序列的arp是首次報道。這個研究發現了4個亞型，提示沒有某一亞型與神經梅毒的存在有獨特的聯系，所以進一步的研究是必要的，用以確定哪一種TP菌株類型與梅毒的不同臨床表現有關聯。葡萄牙里斯本的一項研究發現[17]，在同一患者所有樣品中有相同的亞型，已經可以確定5種分子亞型(亞型10a、14a、14c、14f、14g),其中最常見的14a和最不常發現的10a，據研究表明，這是第一次確定10a亞型。而在蘇格蘭地區[18]，從來自白種男同性戀患者的75分標本中檢測螺旋體DNA，一共確定了6種亞型(14b、14d、14e、14k、14j、14p)，最常見的為14d，接下來為14e、14j、14b、14p、14k，這一研究表明，14d在蘇格蘭地區占主導，同時，也表明了在蘇格蘭男同性戀有驚人的遺傳多樣性水平。而里斯本最常見的14a卻沒有在蘇格蘭地區發現，沒有證據表明14d這一亞型與任何特定的患者、人口特征和地點有聯系，但不能排除有相關特定流行病學、人口或危險因素的其他亞型。Cole等[19]在哥倫比亞做了一項關于二期梅毒的研究，用實時定量PCR確定了4種基因亞型，分別是14d、16d、13d和22a，同時這項實驗第一次定量證實了有著顯著比例的未經治療的二期梅毒患者體內存在相當數量的循環螺旋體。至于TP是如何能長期存在于梅毒患者體內，還需要進一步的研究。在澳大利亞的一項男同性戀梅毒患者研究中[20]，確定了11種亞型(14e、14d、14k、14p、14i、14b、14l、12i、13b、13i、13e)。與其他地區比起來，澳大利亞的TP亞型沒有明顯的不同,最常見的是14e型。該試驗也試圖研究TP亞型與HIV感染、地域分布及梅毒不同臨床表現的關系，遺憾的是，沒有找到它們之間的任何聯系。

2.2.2arp、tpEGJ/tp0548三基因分型法的應用 Marra等[7]在雙基因分型的基礎上率先嘗試并且開創了三基因分型系統，來自美國、中國、愛爾蘭、馬達加斯加島等的173份標本，用三基因分型法可以得到25種菌株類型，而二基因分型法只能得到14種，更重要的發現是，含有14個酸性重復蛋白基因的三個亞型(14a、14d、14e)可以進一步分離成單獨的9個型別，亞型10d、11d、12a和15d也可以用三基因分型系統再進行細分，這證實了三基因分型法更好的基因區分能力，同時，該研究發現最常見的基因分型是14d/f、14d/g和15d/f。國內學者在《Sex Transm Infect》報道了我國TP的分型情況[21]，這項研究地區范圍包括我國東部(南京)、南部(廣州、江門、福州)、西南部(南寧、成都)、北部(天津)、東北部(哈爾濱)，一共確定了27種TP亞型，總的來說，我國TP亞型的分布在地理區域上有著顯著的不同，但是以14d/f最為常見，接下來分別是15d/f、13d/f、16d/f、14a/f。雖然梅毒螺旋體在我國表現出遺傳多樣性，但是14d/f優勢亞型可能暗含著梅毒跨地域傳播的可能性。來自英國倫敦的學者Tipple等[22]在對抵抗大環內酯類抗生素的梅毒螺旋體研究中發現倫敦地區有兩種亞型分布14d/g、14d/f，其中14d/g為主要的類型，而tp0548基因的g型可能與大環內酯抵抗有關。Wu等[15]也用三基因分型系統檢測了136個梅毒患者，檢測出來的亞型分別為14f/f、14f/c、14b/c、14k/f、9f/f、10b/a，其中最常見的為14f/f，而9f/f、10b/a是發現的新的基因型別，為首次報道，這些提示目前在臺灣地區流行的梅毒螺旋體可能不同于美國和我國其他地區的型別。

綜合世界各地的梅毒分型研究結果，梅毒亞型分布具有一定的特點，多個亞型或菌株型在同一地區共存和同一菌株在多地區出現的現象，表現出了遺傳變異的復雜性及亞型分布的多樣性。見表1。

表1 不同國家、地區梅毒亞型分布統計

續表1 不同國家、地區梅毒亞型分布統計

2.3分子亞型與臨床聯系 有研究發現，在兔模型中，不同的梅毒螺旋體菌株感染其病程和臨床表現有所不同，某些菌株是神經梅毒的易感菌株，這些發現對梅毒的臨床治療具有重要的指導意義。相關研究提示，14 d/f可能與神經梅毒的易感性相關[7]，或者14d/f的TP菌株更能逃逸宿主免疫的應答。有學者研究發現[15]，感染14f/f的梅毒患者更可能表現出一期梅毒，可能的解釋為14f/f可使潰瘍表現的更明顯或者持續的時間更長，使得患者和臨床醫師容易發現，還有種推測是14f/f型別的菌株在棉簽拭子標本中或者在運輸過程中能更好地適應環境而存活下來，而14f/f的二期梅毒患者在青霉素治療的過程中更易發生吉海爾反應，至于導致這一現象的原因，尚不清楚。國外有專家認為，TP tpr基因家族是引起梅毒的主要的致病因子，是宿主體液免疫和細胞免疫的主要靶基因，這些蛋白可能在梅毒感染的免疫反應和保護性免疫中起著重要作用[23]。臨床上部分梅毒患者出現“血清固定”現象，Giacani等[24]做梅毒血清固定與梅毒螺旋體tpr基因亞型關系的研究，發現血清固定的形成可能與TP tpr基因的i亞型相關。

3 展 望

雖然梅毒的有效治療方法已在臨床運用了幾十年，但梅毒仍然是一個嚴重危害群眾身心健康的重大公共健康問題。據世界衛生組織估計，全世界每年新發梅毒數可達1 200萬例。分子流行病學被證明在預防和控制一定的傳染性疾病方面是有用的，例如，結核分子桿菌的基因分型能將常規公共衛生調查所不能發現的患者確定出來，以脈沖凝膠電泳為基礎的分子分型已能加強食源性疾病傳染的監督，同樣的，分子流行病學還是應該常規用于性傳播疾病的預防和控制，雖然這些方法已用于淋病的研究[25]。梅毒分子亞型的研究將繼續遵循：(1)新亞型的確定；(2)爆發株的檢測；(3)鑒定各種特殊亞型之間的聯系及其毒力和疾病的轉歸；(4)梅毒分子亞型的研究也將決定是否可消除地方特有的菌株水平的策略[18]。不像其他的性傳播疾病，梅毒有較長的潛伏期，早期的臨床表現不明顯，所有的這些因素導致了其流行病學研究的困難，盡管有這些挑戰，但TP分型系統已經能夠解決一些問題，進一步的分子流行病學的研究和更好地方法有待于挖掘，從而能更好地服務于臨床，解決梅毒患者之疾苦。

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