神經營養因子-3對周圍神經損傷后肌細胞凋亡及Ca2+-ATP酶的影響*

宗海斌，黃媛霞,董玉珍△,周慧聰

(1.新鄉醫學院基礎醫學院機能實驗室，河南新鄉 453003；2.新鄉醫學院第一附屬醫院骨外科，河南衛輝 453100)

周圍神經損傷后肌細胞凋亡導致不可逆性失神經肌萎縮，在神經恢復前有效地抑制細胞的凋亡減緩肌萎縮，一直是中樞、周圍神經損傷治療的一個重要方面[1]。許多學者認為周圍神經損傷后神經營養因子分泌減少，給予外源性神經營養因子-3(neurotrophin 3，NT-3)對促進神經再生及保護肌萎縮均有作用[2]，但其作用機制卻不清楚。本實驗應用NT-3治療大鼠坐骨神經損傷模型,通過觀察治療后其對caspase-3基因、肌細胞凋亡、Ca2+-ATP酶等指標的影響,來探討NT-3 對神經損傷修復和肌萎縮的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 Wistar 成年大鼠60只由新鄉醫學院動物實驗中心提供，雌雄不拘,體質量200～250 g；S-100免疫組織化學染色、細胞蛋白提取、凋亡細胞試劑盒均由湖北武漢博士德生物工程有限公司提供；NT-3 質粒由北京塞百盛生物工程有限公司合成提純。恒溫培育箱、離心機、冰凍切片機購自德國Leica公司；分子生物學凝膠電泳儀購自美國Sigma公司；TJTY-300圖像分析軟件及光鏡購自日本Philips 公司。

1.2實驗方法

1.2.1動物模型制作、分組 健康Wistar大鼠60只，2%戊巴比妥鈉腹腔內注射麻醉(30 mg/kg)，在16倍顯微鏡下暴露坐骨神經，距坐骨神經出口下2 cm處切斷，近端返折縫合到附近肌肉當中，遠斷端用10-0顯微縫線結扎，建立坐骨神經損傷動物模型。分組后使用微量注射器腓腸肌內分別注射生理鹽水和NT-3基因2 μL(濃度為1 μg/μL)，注射后留針2 min，術后所有動物按常規分籠飼養。

1.2.2測定caspase-3蛋白表達 于術后2 h、4 h、8 h、1 d、3 d、7 d、14 d和21 d麻醉下抽取腓腸肌總RNA，采用細胞蛋白提取試劑盒(將肌細胞內的caspase-3蛋白完全提取)進行PCR，反應體系(取2 μL反轉錄產物為模板，按常規聚合酶鏈反應的條件，加入Taq聚合酶0.5 μL，內參照(actin)引物3 μL，先將樣品于94 ℃變性5 min，按下列參數循環35次：94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min,55 ℃延伸1 min；最后72 ℃反應10 min)擴增行凝膠電泳；caspase-3 引物序列包括caspase-3上游引物:5′-AAG AAG ACC ATA GCA AAA GGA G-3′，下游引物:5′-CAC AAA GTG ACT GGA TGA ACC-3′;內參照β-actin 上游引物:5′-CCA A GG CCA ACC GCG AGA AGA TGA C-3′，下游引物:5′-AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C-3′。腓腸肌行石蠟切片加caspase-3抗體染色、封片，光鏡下觀察：50 μL的10%山羊血清(25 ℃) 30 min，50 μL caspase-3兔多克隆抗體(濃度為1∶200)， 4 ℃過夜，50 μL二抗(濃度為1∶150)25 ℃ 20 min，50 μL HRP標記鏈親和素(25 ℃)10 min,二氨基聯苯胺(DAB)顯色,蘇木精復染，陽性信號以胞質出現棕黃進行呈色反應，陰性對照，應用TJTY-300圖像分析軟件測定caspase-3蛋白表達的水平。

1.2.3腓腸肌細胞凋亡檢測 于術后1、4、8周分別取各組失神經腓腸肌標本制成厚5 μm石蠟切片,熒光TUNEL法檢測凋亡細胞，嚴格按TUNEL凋亡原位檢測試劑盒說明書進行操作，被標記的陽性細胞核呈棕黃色。每張切片選取10個不重復視野計數陽性細胞數，按下列公式計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=陽性細胞核數/總細胞核數×100%，取平均數計算。

1.2.4Western blot法檢測肌質網Ca2+-ATP酶 術后1、4、8周將腓腸肌標本取等量蛋白采用凝膠電泳分離，轉膜后用25 mL封閉液室溫封閉1 h，加入一抗孵育3 h，再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，壓片、沖片后采用化學系統檢測各組Ca2+-ATP酶表達量。

2 結 果

2.1caspase-3基因表達 caspase-3基因表達的變化擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳,對含插入NT-3基因片段的產物進行硬膠回收，并對回收產物序列進行酶切鑒定，可見各目的基因及內參條帶清晰，見圖1、2。

圖1 生理鹽水組caspase-3電泳表達

圖2 NT-3 組caspase-3電泳表達

2.2caspase-3蛋白表達 兩組caspase-3蛋白表達在損傷2 h后即開始升高，隨時間增長繼續升高；NT-3組在術后7 d增長比率逐漸下降，caspase-3蛋白的表達2 h后低于生理鹽水組(P<0.05)。見表1，圖3、4。

圖3 21 d對照組caspase-3蛋白表達(×200)

2.3肌細胞凋亡率比較 兩組術后1周均見肌細胞凋亡，比較差異無統計學意義(P>0.05)；4、8周生理鹽水組凋亡細胞明顯增多，高倍鏡下見細胞縮小，形狀不規則，核膜皺縮，核內出現棕黃色顆粒，而NT-3組陽性細胞明顯減少。見表2,圖5、6。

表1 各時間點兩組caspase-3蛋白表達比較

圖4 21 d NT-3組caspase-3蛋白表達(×200)

圖5 8周生理鹽水組肌細胞凋亡情況(×400)

圖6 8周NT-3組肌細胞凋亡情況(×400)

2.4兩組Ca2+-ATP酶變化 1周生理鹽水組Ca2+-ATP酶水平與NT-3組差別不大，而4、8周比較差異有統計學意義(P<0.05)。

圖7 Western blot法Ca2+-ATP酶檢測結果

指標生理鹽水組NT-3組tP肌細胞凋亡率 1周36.42±0.9835.08±1.010.3760.717 4周43.56±1.0738.47±0.933.2530.012 8周52.74±1.2341.56±0.903.8700.005Ca2+-ATP酶 1周38.26±0.3541.54±0.404.3870.692 4周25.72±0.2133.68±0.314.4830.025 8周13.85±0.1421.69±0.254.6730.006

3 討 論

周圍神經損傷后骨骼肌喪失神經沖動的傳入和支配，由于靶細胞缺乏神經營養因子而發生肌萎縮。NT-3是較重要的神經營養因子，能夠維持體外培養的運動神經元的存活，并促進軸突和神經元髓鞘生長，維持肌梭、腱和皮膚傳入感覺神經元的存活，促進神經-肌突觸的成熟，防止神經損傷后肌肉萎縮[3-4]。有研究發現周圍神經損傷后6～12 h內其NT-3水平均下調，2周后NT-3組恢復到對照組水平8倍；經給予外源性NT-3治療后神經損傷后骨骼肌萎縮有明顯的延緩作用，并對軸突再生和神經修復亦具有促進作用[5-6]。但具體作用機制目前研究較少，尚不清楚。

肌細胞凋亡是一種不可逆性的程序性死亡，受細胞內鈣超載、自由基、微循環障礙等調節,又是凋亡相關基因caspase、Bcl-2、p53等表達的結果[7]。實驗表明NT-3特異性的受體是Trk C ，可通過迅速啟動一系列信號轉導途徑,從而實現對神經元自身信號分子如鈣離子通道和神經遞質受體的表達和功能狀態的調節作用，進一步促進Ca2+-ATP酶發揮作用預防失神經骨骼肌萎縮[8-9]。Ca2+-ATP酶是參與調節Ca2+的主要蛋白，其可以使肌質網內和胞質內 Ca2+保持高濃度差,這是骨骼肌收縮和舒張的基礎[10]。周圍神經損傷后引起骨骼肌內的Ca2+-ATP酶能量不足，攝取Ca2+能力下降，細胞內和線粒體內Ca2+的大量積聚、鈣超載可能激活細胞凋亡的啟動程序造成肌細胞凋亡[11]。

caspase是引起細胞凋亡的直接效應物，可以特異地水解底物蛋白，引起染色體凝聚，最終導致細胞凋亡。其中caspase-3是凋亡過程中最重要的蛋白酶,直接介導凋亡實施[12]。研究發現在脊髓損傷后caspase-3表達增加參與了脊髓損傷細胞凋亡的調節，NT-3可能通過抑制caspase-3 基因的轉錄,減少促凋亡因素,抑制神經細胞的凋亡[13]。

本實驗研究表明，caspase-3 基因轉錄和蛋白表達水平在神經損傷后2 h開始增加,但是NT-3組7 d開始下降，而生理鹽水組持續較高水平。應用外源性NT-3 4周后,肌細胞凋亡率較生理鹽水組明顯減低；失神經后4周腓腸肌內 Ca2+-ATP酶明顯下降，NT-3組中Ca2+-ATP酶較生理鹽水組明顯增加,失神經骨骼肌的收縮功能明顯增加(P<0.05)。這說明神經損傷后caspase-3基因表達較高、抗凋亡因素不足和Ca2+-ATP酶下降是導致肌細胞凋亡的原因之一,而給予NT-3干預后骨骼肌細胞的增殖能力增強并能下調活化caspase-3基因和蛋白表達和升高Ca2+-ATP酶,減少促凋亡因素,抑制肌細胞的凋亡，從而減緩和保護失神經后肌萎縮促進神經再生恢復，為腦、脊髓中樞和周圍神經損傷后的修復提供理論依據。

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