局部應用VEGF對失神經皮瓣抗菌力影響的實驗研究

褚立明，張彥軍，穆樹林，張 明，賀房勇，張松林

(河北聯合大學附屬醫院急診科，河北唐山 063000)

截癱患者長期臥床，極易產生褥瘡，褥瘡容易反復感染，不但增加了患者的護理難度，還加重了患者的心理負擔，所以對于截癱患者褥瘡的治療及研究進展，國內外一直有相關報道。有研究發現，在沒有神經支配軟組織傷口中，其細菌增長數量是有神經支配傷口的100倍。1992年，Alison等[1]建立了失神經島狀皮瓣模型觀察發現，在慢性失神經皮瓣中，其細菌生長的數量是有神經支配皮瓣和急性失神經皮瓣組的25倍。因此，截癱患者易患褥瘡，與局部長期失神經有關。血管內皮生長因子(VEGF)是一種能特異性地作用于血管內皮細胞的糖蛋白,具有促進內皮細胞增殖，增加血管通透性，誘導血管生成等多種功能[2]。國內外學者對VEGF在不同類型皮瓣存活中的具體作用和相關機制做過一些報道[3-5]，但是VEGF用于失神經皮瓣白細胞功能的研究，國內外尚未見有報道。為此作者制作了大鼠失神經感染皮瓣模型，通過檢測白細胞功能的一些重要指標，為截癱患者褥瘡的治療提供新的治療途徑。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康4月齡Wister雌性大鼠60只，體質量250～300 g，分籠喂養，自由飲水，室溫(25±2)℃，濕度40%～50%。

1.2方法

1.2.1大鼠慢性失神經感染皮瓣模型的制作[6-7]實驗動物術前1 d 8%硫化鈉脫毛，備皮，溫水清洗試干，實驗前晚停止喂食，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射，麻醉成功后俯臥位固定，在右側腹股溝區設計2 cm×2 cm以腹壁下血管為蒂的島狀皮瓣，皮瓣內下角定位在腹股溝第二乳腺，皮瓣逆行切取，完全游離血管、分離腹部神經并離斷，制作下腹壁失神經皮瓣，所有動物皮瓣原位縫合，室溫下飼養7 d，使其形成慢性失神經模型。整個手術在顯微鏡下進行并注意無創操作。7 d后，按原切口切開皮膚，皮下埋置長1.5 cm 直徑0.5 cm的銅網圓柱體(50目金屬濾網卷成，兩端用硅膠膜封閉，穿刺針可自此進出)，以便抽取滲出液。放回島狀皮瓣，覆蓋圓柱體，1號絲線間斷原位縫合。術后即用7號針頭經皮穿刺，從圓柱體近端刺入，清除滲出后，接種金黃色葡萄球菌懸液(5×107/mL)2 mL。皮瓣手術均由同一人完成，所用器械及材料均經過嚴格消毒且整個過程均在無菌條件下進行。為防止大鼠自行撕咬及皮瓣回縮變形,從而使測量結果更準確,采用石膏環形固定皮瓣。方法是先以數層紗布包裹腹部,再以石膏環形固定于紗布上面,上、下界略超出皮瓣。

1.2.2實驗分組 隨機分成對照組、慢性失神經組和VEGF治療組。對照組、慢性失神經組每瓣皮下注射0.4 mL生理鹽水，分多位點注射。VEGF治療組每瓣皮下注射0.4 mL濃度為1 μg/mL的VEGF,分多位點注射。分別于細菌注射的同時給藥。所有動物觀察96 h后處死，抽出滲液，用于分離白細胞。

1.2.3滲液白細胞的分離 術后96 h從金屬圓柱體內抽出0.5 mL滲出液，用10 mL M199溶液稀釋，反復多次離心，并用0.83% NH3CL-Tris-HCl溶液將紅細胞溶解掉，收集白細胞，懸浮到3 mL M199溶液中。

1.2.4白細胞計數及白細胞活力的檢測 用血球計數器計數總的白細胞數，采用臺盼藍拒染法檢測白細胞的活力=有活力的白細胞數/總白細胞數。

1.2.5化學發光法檢測中性粒細胞氧化暴發功能

1.2.5.1調理酵母多糖，準備發光溶液[8]100 mg酵母多糖加入到20 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液中，煮沸、離心，扔掉上清液，加入到羊血清中，孵育、再離心，扔掉上清液，剩下的酵母多糖加入到10 mL PBS溶液中，待用。17.7 mg的luminol加入到2 mL二甲亞砜和48 mL 0.9% NaCl溶液中，充分混合后，取5 mL加入到45 mL 0.9% NaCl溶液中，配制成50 mL的luminol溶液。

1.2.5.2測定化學發光 取1 mL中性粒細胞懸浮液放入到聚乙烯發光小瓶，加入2 mL luminol溶液和0.1 mL調理過酵母多糖，小瓶被放到液體閃爍計數儀上，在室溫下測定,每次6 s，共測10次，取平均值，結果用每分鐘化學發光脈沖數(CPM)表達。

1.2.6組織細菌計數[8]切取皮瓣皮下及肉膜層少許組織，無菌稱重，以1∶10 比例稀釋在無菌鹽溶液中，并培養在5%血液瓊脂培養皿中，在37 ℃溫箱中孵育48 h，然后計數，用每克組織中含菌落形成單位(CFU)表示。

1.2.7組織學觀察

1.2.7.1肉眼觀察 觀察皮瓣的色澤及膿腫分布情況。

1.2.7.2光鏡觀察 術后96 h從皮瓣中央取材，固定包埋，切片，蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察。

2 結 果

2.1白細胞計數及白細胞活力 術后96 h 3組滲出液中白細胞計數差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組比較，慢性失神經組的白細胞活力顯著降低(P<0.05)。VEGF治療組經VEGF干預后，其白細胞的活力顯著提高，與慢性失神經組比較差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組滲出液中白細胞計數及白細胞活力比較

2.2中性粒細胞化學發光 與對照組比較，慢性失神經組中性粒細胞化學發光顯著降低(P<0.01)。經VEGF治療后，VEGF治療組化學發光顯著提高，與慢性失神經組比較差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組滲出液中性粒細胞化學發光比較

2.3組織細菌計數 與對照組比較，慢性失神經組每克組織細菌計數差異有統計學意義(P<0.01)。經VEGF 治療后，VEGF治療組組織細菌計數顯著降低，與慢性失神經組比較差異有統計學意義(P<0.01)。見表3。

2.4組織學觀察

2.4.1肉眼觀察 對照組：皮瓣彈性較好，色澤尚可，稍有蒼白，散在稀疏的膿腫，未見壞死區。慢性失神經組：皮瓣彈性較差，色澤蒼白，腫脹，膿腫較大，較密集，可見明顯的潰瘍，部分壞死。VEGF 治療組：皮瓣彈性尚可，腫脹，膿腫稀疏，壞死較輕。

表3 各組組織細菌計數比較

2.4.2光鏡觀察 對照組：皮膚表皮、毛囊及皮脂腺等結構基本正常，散在炎性滲出，沒有明顯的組織細胞損傷。慢性失神經組：皮膚結構嚴重破壞，皮膚附件(毛囊、汗腺及皮脂腺)消失，組織壞死明顯，病變部位較深、較廣，炎癥反應較重，可見大片炎性滲出，皮下大量炎性細胞浸潤。VEGF 治療組：皮膚結構尚清，炎癥反應較輕，組織壞死不明顯。

3 討 論

許多實驗均證實了失神經能夠增加軟組織的易感性。然而這一事實的確切機制卻一直不清楚。有實驗證實了失神經能夠使血管舒縮紊亂，并能導致軟組織水腫，而壓力和失神經所導致的水腫是淋巴性和靜脈性的，它能導致皮膚免疫功能的改變，而這些改變最終導致了皮膚抗感染能力的低下，增加了軟組織在褥瘡中受破壞的程度。有學者也證實了壓力、局部缺血以及組織水腫所導致的細菌大量繁殖與組織失神經有密切關系。缺少神經生長因子(NGF)或其他神經遞質確實能夠降低機體對于局部組織感染發生后應激反應的能力，這個結論在慢性失神經感染皮瓣模型中得到了證實。有實驗證實P物質能夠增強機體組織的炎性反應，所以在失神經的組織中炎性反應明顯減弱。NGF被認為能夠影響非特異性炎性細胞的氧化物質代謝[9]，而且能夠調節中性粒細胞的趨化性。所以無論是在急性失神經皮瓣還是在慢性失神經皮瓣，軟組織中的局部NGF水平都會降低，特別是在慢性失神經皮瓣中，表現尤為突出?？梢詮囊粋€側面解釋為什么失神經的組織比沒有失神經的組織更具有易感性。然而，缺乏神經遞質和NGF到多大程度才能影響機體的抗感染能力，目前還不清楚。

Kim等[10]研究發現VEGF可以刺激細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、內皮細胞選擇素和血管細胞黏附分子-1(vascular cellular adhesion molecule-1，VCAM-1)的mRNA的表達，這種上調效應可被KDR(Flk-1)的拮抗劑所抑制，也可被磷脂酶C，NF-κB、鞘氨醇激酶與蛋白激酶C的抑制劑所抑制。但抑制NO合酶及有絲分裂原激活蛋白激酶的激酶后對此無影響。凝膠移動分析顯示VEGF可以刺激NF-κB的活性，上述結果說明VEGF增加VCAM-1和ICAM-1蛋白質表達及促進白細胞的黏附是通過NF-κB信號通路實現的。VEGF增加了VCAM-1、ICAM-1蛋白表達和主要組織相容性復合體Ⅰ、Ⅱ的表達，促使自然殺傷細胞(natural killer，NK)與內皮細胞黏附，并且VEGF對單核細胞具有趨化性。因此，VEGF能吸引單核、巨噬細胞到達損傷處，誘導MHC、ICAM-1等分子表達，參與組織的免疫反應[11]。另外，ICAM-1主要與中性粒細胞表面的LFA-1和Mac-1結合， Mac-1表達于中性粒細胞、單核細胞、NK細胞上，是中性粒細胞表達的主要整合素家族成員，可促進中性粒細胞的吞噬功能和氧自由基的釋放[12]。因此，VEGF有增強白細胞特別是中性粒細胞功能的作用。

本實驗研究結果顯示，術后96 h VEGF治療組的白細胞活力較慢性失神經組顯著提高，中性粒細胞化學發光亦顯著提高，組織細菌計數顯著降低。這充分說明VEGF改善了白細胞的功能水平，提高了白細胞吞噬細菌、殺滅細菌能力，從而提高了皮瓣清除細菌的能力。

總之，從本實驗的數據中可以得出，在感染島狀皮瓣模型中，慢性失神經不但增強了細菌生長繁殖的能力，而且降低了白細胞的功能。適量的VEGF可以增強失神經皮瓣的抗感染能力，為修復重建外科提供新的途徑，但這并不是說VEGF沒有缺點，和其他細胞因子一樣，在機體中它也是扮演著雙重角色，它既能改善微循環、增強血供，以及增強白細胞功能，又有誘導炎性反應的作用，從而加重組織的炎性水腫。所以，進一步研究VEGF在失神經皮瓣中對白細胞功能影響的作用機制，以便在應用時選擇適當的給藥方法和給藥途徑，減少VEGF帶來的不利影響。

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