脫細胞膀胱基質補片的生物相容性研究

范雪梅,徐惠成,王朝麗

(1.成都軍區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科,成都 610083；2.第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院婦產(chǎn)科,重慶 400038；3.中國人民解放軍324醫(yī)院體檢中心,重慶 400020)

近年來,隨著材料科學和組織工程學的進步,脫細胞基質成分的組織工程補片大量涌現(xiàn)，并逐漸在盆底修復重建手術中采用，替代薄弱受損的盆底筋膜組織[1]。膀胱損傷后能迅速進行自我修復，用膀胱基質修復受損組織是合乎邏輯的選擇[2]。目前，脫細胞膀胱基質(acellular bladder matrix，ABM)已成為泌尿外科研究和應用的熱點，但還未見其用于盆底修復方面的報道。本研究在前期實驗基礎上采用表面活性劑聯(lián)合酶消化法[3-5]，對新鮮健康豬膀胱(屠宰場獲取)進行脫細胞處理，制成 ABM補片，采用體內(nèi)外相結合的實驗方法對生物相容性進行評價，為其在盆底修復方面的應用進一步提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康新西蘭大白兔15只,體質量2.1～2.5 kg,雌性；由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供,實驗動物使用合格證:SCXK(渝)2007-0002。

1.2儀器與試劑 苯甲基磺酰氟(北京鼎國生物技術有限公司),三羥甲基氨基甲烷(BBI)，Triton X-100、DNA酶及RNA酶(上海生工有限公司)，十二烷基硫酸鈉(捷瑞生物工程有限公司)，苯酚(北京化工廠)，聚丙烯網(wǎng)片( 美國強生公司)。凍干機，掃描電鏡，CO2培養(yǎng)箱，CK2型倒置相差顯微鏡，BIO-RAD 680 XR型酶標儀。

1.3方法

1．3．1材料浸提液制備 參照ISO10993-5(2009)[6]，浸提介質為RPMI1640培養(yǎng)液，浸提比例為6 cm2/mL，培養(yǎng)液完全浸沒樣品，密封后在37 ℃無菌條件下浸泡24 h制成浸提液。完成后用RPMI1640培養(yǎng)液分別稀釋，制備100.0%、50.0%、25.0%、12.5%的浸提液，放入冰箱4 ℃保存(實驗組)。空白對照組： RPMI1640培養(yǎng)液。陰性對照組：聚苯乙烯(浸提方法同試驗樣品)。陽性對照組：含0.5%苯酚溶液(由RPMI1640培養(yǎng)液配置)。

1．3．2細胞毒性試驗 凍存 L-929 細胞復蘇后經(jīng)過兩次傳代，取對數(shù)生長期的L929細胞，用0.25%胰蛋白酶消化2～3 min。倒去消化液，RPMI1640培養(yǎng)液將細胞稀釋至1×105個/mL。將L929細胞懸液加至96孔細胞培養(yǎng)板，100 μL/孔，在37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束后，棄去培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)液，按實驗分組分別進行換液(每組5孔)，再把培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，于1、3、5 d各取出一塊培養(yǎng)板，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、照相，每孔加入MTT染色劑50 μL(1 mg/mL)，置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h。吸盡原液，每孔加入100 μL異丙醇，吹打震蕩，充分混勻，用酶標儀以檢測波長570 nm，參考波長630 nm，分別測定各孔OD值。并根據(jù)公式計算細胞相對增殖率(RGR)=供試品組(陰性、陽性組) OD值/空白對照組OD值×100%。按照評分標準(RGR≥100%為0級，75%～99%為1級，50%～74%為2級，25%～49%為3級，1%～24%為4級，0%為5級),對樣品細胞毒性程度進行評價。

1．3．3溶血試驗 參照ISO10993-4(2009)設計實驗。采集新西蘭兔血2 mL與1 mL肝素混合，并加1.5 mL生理鹽水稀釋備用。設實驗組(ABM生理鹽水100%浸提液)；陰性對照組(生理鹽水)；陽性對照組(蒸餾水)各5 mL,每組5支試管。每支試管加入稀釋的抗凝兔血0.1 mL，37 ℃孵育60 min。離心10 min(3 000 r/min)，觀察上層液體顏色及紅細胞沉積情況。酶標儀492 nm處測OD值，計算溶血率，溶血率=[待測OD值 (Dt)-陰性對照組OD值(Dnc)]/[陽性對照OD組(Dpc)-Dnc]×100%。

1．3．4陰道埋植試驗 新西蘭大白兔10只,雌性，未孕未產(chǎn)。分為實驗組和對照組，每組5只。采用3%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射麻醉,陰道消毒,剪開陰道直腸交界處皮膚，分離陰道后壁黏膜與直腸間隙，達頂點處，長約2.0～2.5 cm[7]。ABM裁剪成10 mm×20 mm大小植入實驗組家兔陰道后壁黏膜下方，將目前臨床上最常用于盆底修復的人工合成材料聚丙烯網(wǎng)片[8]剪成同樣大小植入另一組家兔陰道作對照。術后每天觀察手術切口及動物反應變化，于12周處死動物后采集樣本(植入材料及表面附著組織),甲醛固定，石蠟包埋,伊紅-蘇木素染色制成病理切片，在光鏡下觀察炎癥反應、新生血管形成和成纖維細胞增殖情況。

2 結 果

2．1細胞毒性試驗 倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)1 d后(圖1)，實驗組細胞貼壁生長，形態(tài)良好，為長梭形或不規(guī)則三角形與陰性對照組相似；陽性對照組細胞無明顯生長，變圓、皺縮。隨時間延長可見實驗組和陰性對照組細胞數(shù)量逐漸增多，兩組相比未見明顯差異，而陽性對照組隨著時間的延長，細胞數(shù)目減少，細胞死亡。染色后，實驗組 MTT 結晶物密度與陰性對照組相似，呈現(xiàn)為透明的藍紫色，陽性組染色后變色不明顯。從表1可見，培養(yǎng)同樣的時間實驗組各濃度的 OD 值之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；隨培養(yǎng)時間延長，各濃度組OD值都逐漸增高，不同濃度的實驗組與陰性對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；各實驗組均與陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。陽性對照組細胞毒性級別為4～5級，實驗材料組細胞毒性級別與陰性對照組同為 0～1級，可以認為ABM無細胞毒性。

2.2溶血試驗 生理鹽水組和實驗組靜置后個管內(nèi)均可見血細胞沉積，而蒸餾水組各管顏色均一，呈淡紅色，無明顯血細胞沉積。見表2。陰性對照組與實驗組OD值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)， 與陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。實驗組溶血率為1.5%，低于5%，因此判定ABM符合生物材料的溶血試驗要求。

a：陰性對照組；b：陽性對照組；c：實驗組100%浸提液；d：實驗組12.5%浸提液。

圖1 倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)1 d各組L929細胞的形態(tài)變化(×100)

表2 各組吸光度值和溶血率測定(n=5)

2.3陰道埋植試驗

2.3.1大體觀察 ABM植入陰道后，傷口無紅腫、滲液等炎性反應，植入部位未見紅腫、侵蝕和纖維包塊形成，術后12周未見ABM補片殘存；聚丙烯組均出現(xiàn)網(wǎng)片皺縮，有2例(40%)出現(xiàn)材料穿透陰道即侵蝕反應。

2.3.2組織病理學觀察 術后12周，ABM膠原變性斷裂，成纖維細胞增多，周邊圍繞極少的嗜酸性粒細胞及淋巴細胞，補片已基本降解。聚丙烯在體內(nèi)未發(fā)生降解，網(wǎng)孔周圍有較多成纖維細胞環(huán)繞，膠原纖維較紊亂，炎癥反應呈中、重度，伴有壞死。見圖2。

A:ABM補片大部分降解斷裂呈紅色均質(黑色箭頭)，與周圍宿主基質融合。B:聚丙烯網(wǎng)片(黑色箭頭)網(wǎng)孔周圍膠原較少，有壞死(紅色箭頭)。

圖2陰道植入ABM和聚丙烯12周后的光鏡下組織學改變(HE染色×100)

3 討 論

理想的盆底修復重建替代材料應具備無菌、持久耐用、不致癌、價廉、無抗原反應并且能抵抗機體組織重塑[9-10],目前尚沒有可以滿足以上全部要求的替代材料。脫細胞基質材料由于不含細胞表面受體的特異識別位點，不易引發(fā)受體的免疫排斥反應，增加了組織相容性，減少了感染概率，提供了一個有利于正常的細胞生長,分化,血管生成的環(huán)境，能快速與宿主整合，這是組織工程移植物能長期存在體內(nèi)發(fā)揮作用的關鍵。脫細胞移植物按照來源可分為同種異體和異種移植物。由于同種異體的移植材料來源有限,價格較高,且涉及倫理問題,目前已較少作為移植材料。異種移植材料較易獲得，國外已經(jīng)商品化的異種移植物包括牛闊筋膜、牛心包、馬心包、豬小腸黏膜下組織、豬真皮、胎牛皮、豬膀胱、豬心臟瓣膜等[11-12]，在泌尿外科、耳鼻喉頭頸外科、普通外科、整形外科中已有應用，但在婦產(chǎn)科僅有脫細胞豬真皮和豬小腸黏膜下組織作為盆底修復補片的少量報道。

生物相容性是生物材料研究中始終貫穿的主題,主要采用體外法和體內(nèi)植入試驗對材料生物相容性進行評價[13]。通過相關的物理化學法對其性能進行評價，并在簡化的體外模型表面上研究材料的細胞相容性即為體外法；將材料植入動物體內(nèi)一段時間取出觀察其炎癥反應及組織長入情況，即為體內(nèi)植入試驗，組織學檢查是其主要檢查方法。本課題組在前期實驗研究中將5種最常用的豬脫細胞基質材料，進行體外相關特性檢測，結果發(fā)現(xiàn)ABM具有最長的降解周期、最強的抗菌性能、最高的吸水性、最好的生物力學性能，初步認為適合于盆底特殊環(huán)境[14]。因此，本實驗參照ISO10993制定的相關方法和標準，對ABM的生物相容性進行全面評價。

在細胞毒性實驗中，各實驗組、空白組和陰性對照組的細胞隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量逐漸增加，說明12.5%、25.0%、50.0%和100.0%的ABM浸提液對L929細胞的增殖無影響。細胞毒性與被測材料的量尤其是表面積有關，實驗設計了不同濃度的浸提液比較，其結果差異無統(tǒng)計學意義，進一步說明本實驗材料對細胞沒有毒性，符合生物材料的無毒性要求。

在溶血實驗中,陰性對照組和實驗組靜置后各管內(nèi)均見到有血細胞的沉積，兩組OD值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而陽性對照組呈淡紅色，出現(xiàn)明顯溶血，其OD值與陰性對照組和實驗組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。材料浸提液溶血率合格,表明本實驗材料無溶血作用。

ABM補片在植入家兔陰道12周后已基本降解；顯示呈極輕、輕度炎癥反應，ABM補片與宿主組織融合，纖維細胞增殖明顯，表現(xiàn)出良好的組織相容性。而聚丙烯網(wǎng)片炎癥反應呈中、重度，伴有壞死，出現(xiàn)了臨床上常見的并發(fā)癥即侵蝕。關于聚丙烯網(wǎng)片和生物材料用于腹部疝修補的研究已大量報道，但植入陰道的研究相對比較缺乏。同樣的材料經(jīng)腹部手術證明是有用的，而其用于陰道手術中可能無效[15]。本實驗將材料植入陰道更好地反映其作為盆底補片的生物相容性。

本實驗結果表明,ABM有良好的生物相容性,為其將來應用于盆底重建替代材料方面奠定了一定基礎。在下一步工作中,針對盆底重建替代材料需要在體內(nèi)持久修復的要求，將ABM進行改性處理，以提高抗酶解能力和維持力學性能的穩(wěn)定，同時延長體內(nèi)植入時間，觀察材料植入體內(nèi)后生物力學性能的變化，為該材料應用于盆底修復重建提供理論依據(jù)。

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