血管緊張素Ⅱ及氯沙坦對大鼠腎系膜細胞SUMO蛋白表達的影響*

黃 煒,周雪琴,徐 玲,徐 勇,楊茂君

(瀘州醫學院附屬醫院內分泌科，四川瀘州 646000)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病特有而嚴重的微血管并發癥，其發病機制尚不清楚，是終末期腎病和腎功能衰竭的主要原因之一。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是目前公認的參與DN發病的重要致病因子，其受體拮抗劑(ARB)在臨床上也被廣泛應用，但嚴格的血糖、血壓等控制并不能完全阻止DN的發生、發展，因此，進一步研究DN發病機制具有重要意義。小泛素相關修飾物(small ubiquitin related modifier,SUMO)修飾是與泛素化修飾類似的蛋白質翻譯后修飾，在細胞信號轉導、核質運輸與轉錄調控等方面發揮重要作用，參與多條信號通路(包括TGF-β、NF-κB、MAPK信號通路)的調控。最新的研究發現，SUMO化修飾在多種炎癥性疾病和器官纖維化進程中發揮著重要的作用，并且參與了糖尿病的發病，但SUMO蛋白與DN的關系鮮見文獻報道。為明確SUMO蛋白與DN的關系，本研究觀察AngⅡ及氯沙坦刺激的大鼠腎系膜細胞不同亞型SUMO蛋白(SUMO1、SUMO2/3)的表達，進一步研究DN發生機制并為其防治提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠腎系膜細胞(HBZY-1，中國典型培養物保藏中心)，兔抗大鼠SUMO1單克隆抗體(英國Abcam)，兔抗大鼠SUMO2/3多克隆抗體(美國Millipore)，小鼠抗大鼠GAPDH抗體(碧云天公司)，AngⅡ(美國sigma)，氯沙坦鉀(中國食品藥品檢定研究所),總蛋白抽提試劑盒(美國Chemieon)，5×Western上樣緩沖液(碧云天公司)，總RNA提取試劑盒(北京天根生化)，RT-PCR試劑盒(大連寶生物)，BCA蛋白定量試劑盒(美國Pierce)，FTC2000型PCR儀，ECL化學發光試劑盒(美國Millipore)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養 HBZY-1常規培養于含10%小牛血清的低糖(5.6 mmol/L葡萄糖)DMEM培養基中，培養條件37 ℃、5%CO2，對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2實驗分組 在大鼠腎系膜細胞的DMEM培養液中加入以下處理因素，將細胞分為5組：(1)正常對照組(NC組)，不加處理因素；(2)10-9mol/L AngⅡ 組(A1組)；(3)10-7mol/L AngⅡ 組(A2組)；(4)10-5mol/L AngⅡ組(A3組)；(5)氯沙坦預處理組(MT組)：10-5mol/L氯沙坦預處理0.5 h后再加入10-5mol/L Ang Ⅱ。分別作用24、48、72 h后，收獲細胞。

1.2.3Western blot檢測SUMO1、SUMO2/3蛋白表達 取細胞加蛋白抽提液，吹打，4 ℃離心后取上清液。BCA法測蛋白濃度,加5×Western上樣緩沖液混勻,沸水煮5 min致蛋白變性。加樣品電泳，轉膜，封閉，分別加兔抗大鼠SUMO1單克隆抗體(1∶800)，兔抗大鼠SUMO2/3多克隆抗體(1∶600),小鼠抗大鼠GAPDH單克隆內參抗體(1∶2 000)4 ℃過夜，然后加HRP標記的羊抗兔IgG孵育(SUMO1、SUMO2/3)、HRP標記的羊抗小鼠IgG(內參)，化學發光顯影，LAS-3000紫外凝膠成像系統成像，Quantity One軟件測蛋白條帶光密度值。實驗重復3次。SUMO1、SUMO2/3蛋白濃度以SUMO1、SUMO2/3與GAPDH蛋白條帶平均光密度值之比表示。

1.2.4RT-PCR法測定SUMO1、SUMO2/3 mRNA 總RNA提取試劑盒提取各組腎系膜細胞總RNA，取總RNA 4 μL為模板反轉錄成cDNA于PCR反應管中擴增，SUMO1上游引物：5′- TAT GGA CAG GAC AGC AG-3′，下游引物：5′-CCA TTC CCA GTT CTT TTG-3′，擴增產物為170 bp；SUMO2/3上游引物：5′-GAC GAG AAA CCC AAG GA-3′，下游引物：5′-CTG CCG TTC ACA ATA GG-3′，擴增產物為141 bp;內參GAPDH上游引物：5′-CCT CAA GAT TGT CAG CAA T-3′，下游引物：5′-CCA TCC ACA GTC TTC TGA GT -3′ 擴增產物為 141 bp。反應條件：預變性94 ℃ 2 min，變性94 ℃ 30 s，退火(退火溫度為SUMO1：50.8 ℃，SUMO2/3：51.6 ℃)30 s，延伸72 ℃ 1 min;擴增30個循環后上樣2%瓊脂糖凝膠電泳，采用紫外凝膠成像系統成像，以SUMO1、SUMO2/3的灰度值除以GAPDH的灰度值分別得到各檢測指標相對灰度值，該相對灰度值代表各指標mRNA的相對表達量。

2 結 果

2.1A3組作用不同時間對系膜細胞SUMO蛋白表達的影響 與NC組比較，作用24 h A3組SUMO1、SUMO2/3蛋白表達均明顯增強(P<0.01)；隨作用時間延長(48、72 h)，SUMO1和SUMO2/3蛋白表達量均逐步減弱，作用72 h后SUMO1、SUMO2/3表達量與NC組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、圖1。

2.2不同濃度AngⅡ和氯沙坦對腎系膜細胞SUMO蛋白表達的影響 作用24 h后，A1、A2、A3組與NC組比較，SUMO1蛋白表達分別增加30%、40%和50%，SUMO2/3蛋白表達分別增加30%、70%和14%，AngⅡ呈濃度依賴性影響SUMO1蛋白表達(P<0.01)。MT組與NC組比較，SUMO1和SUMO2/3表達均增加(P<0.01)。見表2、圖2。

2.3不同濃度AngⅡ和氯沙坦對腎系膜細胞SUMO mRNA表達的影響 與NC組比較，A1、A2、A3、MT組24 h SUMO1、SUMO2/3 mRNA的表達增加(P<0.01)。見表3、圖3。

圖1 NC組與A3組不同時間點SUMO蛋白表達(Western blot)

圖2 各組24 h后SUMO蛋白表達(Western blot)

圖3 各組作用24 h后SUMO mRNA表達(RT-PCR)

組別SUMO1SUMO2/3NC組0.341±0.0010.112±0.011A3組24 h1.224±0.0780.440±0.032A3組48 h0.842±0.0200.184±0.006A3組72 h0.522±0.0300.145±0.032

表2 Western blot 檢測各組24 h SUMO1、SUMO2/3蛋白的表達

表3 RT-PCR檢測各組24 h SUMO1、SUMO2/3 mRNA表達

3 討 論

SUMO蛋白是廣泛存在于真核生物的高度保守的小蛋白家族(相對分子質量約為11×103)，在細胞信號轉導、核質運輸與轉錄調控等方面發揮重要作用[1]。目前已發現有4個亞型:SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4， SUMO2與SUMO3氨基酸序列非常接近，常合寫成SUMO2/3。因各亞型SUMO蛋白在組織和細胞結構中的分布與動態變化不同，其功能也不盡相同。SUMO1和SUMO2/3在各種組織中均有表達，SUMO1主要修飾生理蛋白；SUMO2/3主要修飾應激蛋白，參與滲透壓、熱休克、氧化應激和DNA損傷等過程[2]。SUMO化參與了NF-κB、PPARγ、TGF-β和MAPK等多信號通路的調控[3-4]。

已有研究表明，SUMO化修飾參與了糖尿病發病。有學者發現,SUMO4通過與I-κB作用，負性調節NF-κB的轉錄活性，與1型糖尿病相關[5-6]。此外，與糖尿病發病相關的葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)也受到SUMO化調節[7]。Woo等[8]證實AGEs可通過SUMO化修飾介導糖尿病血管內皮功能障礙，參與了糖尿病大血管并發癥的發生。

AngⅡ是目前公認的參與DN發病的重要致病因子，糖尿病患者腎臟局部 AngⅡ活性增高，促進腎小球硬化[9]。研究證實Ang Ⅱ能維持并增強腎臟的微炎癥反應，激活NF-κB、TGF-β等信號，參與腎小球損傷[10]。AngⅡ與血管緊張素受體(AT受體)結合后發揮作用，目前AT受體按其作用、結構差異等主要分為AT1和AT2受體。查閱相關文獻并結合臨床實踐后發現，嚴格的血糖、血壓控制(ACEI、ARB、CCB等)，并不能完全阻止DN的發生、發展，因此，進一步研究AngⅡ在DN發病中的作用具有重要意義[11]。

本研究將DN發病的重要致病因子AngⅡ與SUMO化結合起來，探討AngⅡ及氯沙坦對大鼠腎系膜細胞SUMO表達的影響。研究結果提示，AngⅡ可刺激腎系膜細胞SUMO1、SUMO2/3表達增加，并具有一定的濃度依賴性，提示SUMO化修飾可能參與了DN發病的相關信號通路(如NF-κB)中重要信號蛋白的翻譯后修飾，激活其靶基因的轉錄和翻譯。相關研究表明：大鼠肝纖維化模型SUMO1表達增加，大鼠低氧性肺動脈高壓(HPH)形成過程中SUMO1表達增強[12]；以及SUMO1 siRNA沉默肝癌細胞(SMMC-7721)SUMO1基因表達后，肝癌細胞生長明顯受到抑制[13]。提示SUMO作為應激誘導蛋白，廣泛參與上述組織器官病變。本研究發現，AngⅡ介導的SUMO表達增強不能被氯沙坦所逆轉，據此作者推測，氯沙坦是非肽類的選擇性AT1受體拈抗劑，競爭性的拮抗Ang Ⅱ的生物學效應。本實驗中，Ang Ⅱ可能通過作用于AT2受體或其他旁路途徑激活SUMO化相關特異性修飾酶，上調SUMO基因和蛋白的表達。研究中作者還發現，對AngⅡ的刺激，SUMO蛋白的表達表現出很強的時效性，各刺激組SUMO蛋白表達在24 h達在高峰后隨之遞減，作用72 h后SUMO2/3表達量與NC組相當；并且不同亞型的SUMO蛋白反應并不一致，如腎系膜細胞SUMO2/3在10-7mol/L Ang Ⅱ干預組表達最強，未發現10-5mol/L 的 Ang Ⅱ 進一步促進SUMO2/3的表達，分析原因，一方面各亞型SUMO蛋白在細胞中動態變化和功能狀態不盡相同，SUMO2/3主要修飾應激蛋白，其合成與降解有較強的時效性[14]；另一方面可能與受體數量下降和受體飽和度有關[15]。

綜上所述,Ang Ⅱ 可呈一定的濃度依賴性地刺激大鼠腎系膜細胞SUMO蛋白表達，SUMO1、SUMO2/3對Ang Ⅱ刺激的反應不盡相同，這種改變不能被氯沙坦所阻斷，可能參與DN的發病，其確切機制有待進一步研究。

參考文獻:

[2] Ulrich HD.Ubiquitin,SUMO,and Phosphate:How a trio of posttranslational modifiers governs protein fate[J].Mol Cell,2012,47(3):335-337.

[3] Wang YE,Pernet O,Lee B.Regulation of the nucleocytoplasmic trafficking of viral and cellular proteins by ubiquitin and small ubiquitin-related modifiers[J].Biol Cell,2012,104(3):121-138.

[4] Hannoun Z,Greenhough S,Jaffray E,et al.Post-translational modification by SUMO[J].Toxicology,2010,278(3):288-293.

[5] Sarge KD,Park-Sarge OK.SUMO and its role in human diseases[J].Int Rev Cell Mol Biol,2011,288(2):167-183.

[6] Wang CY,Yang P,Li M,et al.Characterization of a negative feedback network between SUMO4 expression and NF-kappaB transcriptional activity[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,381(4):477-481.

[7] Liu L,Omata W,Kojima I,et al.The SUMO Conjugating Enzyme Ubc9 is a Regulator of GLUT4 Turnover and Targeting to the Insulin-Responsive Storage Compartment in 3T3-L Adipocytes[J].Diabetes,2007,56(20):1977-1985.

[8] Woo CH,Shishido T,McClain C,et al.Extracellular signal-regulated kinase 5 SUMOylation antagonizes shear stress-induced anti-inflammatory response and endothelial nitric oxide synthase expression in endothelial cells[J].Circ Res,2008,102(5):538-545.

[9] Lai KN,Leung JC,Tang SC.The renin-angiotensin system[J].Contrib Nephrol,2011,170(2):135-144.

[10] Kim JM,Uehara Y,Choi YJ,et al.Mechanism of attenuation of pro-inflammatory Ang Ⅱ-induced NF-κB activation by genistein in the kidneys of male rats during aging[J].Biogerontology,2011,12(6):537-550.

[11] Doi T,Mima A,Matsubara T,et al.The current clinical problems for early phase of diabetic nephropathy and approach for pathogenesis of diabetic nephropathy[J].Diabetes Res Clin Pract,2008,13(8):82-90.

[12] 肖志華,郭武華,張吉翔.SUMO-1在實驗性大鼠肝纖維化形成過程中的作用[J].世界華人消化雜志,2010,18(14):1422-1427.

[13] 郭武華,袁麗華,肖志華,等.SUMO-1基因siRNA抑制肝癌細胞SMMC-7721生長的研究[J].天津醫藥,2010,38(1):4-6.

[14] Galanty Y,Belotserkovskaya R,Coates J,et al.RNF4,a SUMO-targeted ubiquitin E3 ligase,promotes DNA double-strand break repair[J].Genes Dev,2012,26(11):1179-1195.

[15] 樊志榮，盧義俠，李長齡.腎病綜合征大鼠腎小球血管緊張素Ⅱ受體功能變化及其機制[J].腎臟病與透析腎移植雜志，2003,12(2):122-125.