FISH檢測宮頸上皮內(nèi)瘤變及其旁組織中hTERC基因表達的變化及意義*

曹志星呂威趙曄莫海波謝亞峰吳曉媚李玉梅周賓范思格陳細(xì)妹

FISH檢測宮頸上皮內(nèi)瘤變及其旁組織中hTERC基因表達的變化及意義*

曹志星①呂威①趙曄①莫海波①謝亞峰①吳曉媚①李玉梅①周賓①范思格①陳細(xì)妹①

目的：檢測宮頸活檢組織中上皮內(nèi)瘤變（CIN）及其旁組織中hTERC基因的表達情況，對比分析其陽性率的變化，試圖找到基因水平上CIN手術(shù)治療范圍。方法：采用熒光原位雜交技術(shù)（FISH）檢測63例宮頸活檢標(biāo)本中hTERC基因的表達變化情況。結(jié)果：宮頸高級別上皮內(nèi)瘤變（HSIL）區(qū)、瘤變邊緣≤1 mm、1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm、2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm以及3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm的hTERC基因陽性率分別為100%、92.31%、87.18%、64.10%和30.77%，其中，HSIL與瘤變邊緣2 mm以內(nèi)范圍各點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；HSIL與瘤變邊緣2 mm以外范圍各點比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；宮頸低級別上皮內(nèi)瘤變（LSIL）區(qū)、瘤變邊緣≤1 mm范圍、1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm、2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm以及3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm的hTERC基因陽性率分別為41.67%、25.00%、4.17%、4.17%和4.17%，其中，LSIL與瘤變邊緣1 mm以內(nèi)范圍各點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而LSIL與瘤變邊緣1 mm以外范圍點比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：活檢標(biāo)本中，隨著距瘤變區(qū)范圍的增加，hTERC基因的陽性率明顯下降，其中，距瘤變邊緣＞2 mm和＞1 mm或許可以分別作為HSIL和LSIL基因水平上（更精確意義上的）CIN的手術(shù)治療范圍。

熒光原位雜交； 宮頸上皮內(nèi)瘤變； hTERC基因； 宮頸活檢組織； 手術(shù)治療范圍

在世界范圍內(nèi)，女性宮頸癌發(fā)病率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第2位[1]。近年來，其發(fā)病呈年輕化趨勢，但因?qū)m頸癌有較長的癌前病變期，早期診斷及合理治療便成為改善預(yù)后的關(guān)鍵[2]。目前研究得知，宮頸細(xì)胞由非典型性異常病變細(xì)胞轉(zhuǎn)化成癌細(xì)胞的過程中幾乎都伴有3號染色體長臂的擴增，其中涉及到的最重要的基因可能是人染色體末端酶基因（human telomerase gene，hTERC），它有望成為非典型細(xì)胞癌變的基因[3]。Heselmeyer-haddad等[4]研究認(rèn)為hTERC基因可以作為預(yù)測高度病變（HSIL）的指標(biāo)，隨訪這些病例1～3年后，hTERC基因擴增病例中CINⅠ/Ⅱ進展到CINⅢ多于hTERC基因不擴增病例，表明特異的基因組改變是CIN發(fā)展到宮頸癌所必需的[5]。同時，多項研究表明，采用FISH技術(shù)檢測宮頸細(xì)胞hTERC基因的陽性率，可作為宮頸上皮內(nèi)瘤變由低級別進展到高級別的指標(biāo)，還可以提高宮頸癌前病變的篩查幾率，是一種損傷較小的、比較可靠的檢測手段[6-10]。有研究報道不同制片方法中，hTERC基因雜交成功率石蠟包埋組織切片為85.7%，其熒光信號滿意率也最高，且在指導(dǎo)宮頸病變及宮頸癌的治療中，石蠟包埋組織切片法的染色體破壞最小，實際意義更大。因而，不同于以往的使用脫落細(xì)胞進行的研究，本實驗全部采用組織活檢標(biāo)本。同時，除檢測CIN處的hTERC基因陽性率外，還對病變旁組織做不同范圍的hTERC基因表達研究，試圖找到規(guī)律性變化，探討基因水平上CIN的手術(shù)治療范圍。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2013年10月-2014年7月本院宮頸組織活檢標(biāo)本63例，每例均完整包含連續(xù)的瘤變組織及其旁組織（距瘤變邊緣≥4 mm）。其中，低級別病變24例，高級別病變39例，年齡22～62歲，取標(biāo)本前所有患者均未進行放療、化療及其他特殊治療。另外選取20例正常宮頸組織活檢標(biāo)本建立閾值。

1.2 FISH探針 北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的TERC/CSP3 DNA雙色探針。TERC基因標(biāo)記在3q26.3位點，CSP3 DNA標(biāo)記在3號染色體著絲粒處（3q11.1-q11.1），分別用紅色和綠色熒光信號標(biāo)記，以CSP3探針作為對照。

1.3 方法

1.3.1 樣本制備 將普通載玻片清洗干凈后，涂多聚賴氨酸以防脫片，自然晾干備用。將預(yù)先篩選出的石蠟包埋組織做2 μm連續(xù)切片，展開后撈片，置70 ℃烤箱中2 h。

1.3.2 樣本預(yù)處理 將玻片置于二甲苯中脫蠟，兩缸，各10 min，依次經(jīng)100%乙醇、85%乙醇、75%乙醇至去離子水，各1缸，各2 min，然后置于火力60的微波爐內(nèi)水煮20 min，在2×SSC溶液中浸泡5 min后晾干，加胃蛋白酶20 μL（20 mg/mL），消化5 min左右，室溫下2×SSC溶液中漂洗2次，5 min/次。最后將玻片依次置于75%乙醇、85%乙醇、100%乙醇各2 min脫水，烤片至56 ℃，干燥備用。

1.3.3 雜交 避光環(huán)境中，將探針混合液10 μL（2 μL探針，8 μL雜交緩沖液）滴于玻片雜交區(qū)域，加上蓋玻片，封膠；83 ℃水浴中變性5 min，將玻片置于預(yù)熱的濕盒中，42 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜雜交。

1.3.4 洗片 第2天在暗處移去蓋玻片，依次經(jīng)46 ℃預(yù)熱的2×SSC溶液和NP40溶液（40 mL 2×SSC溶液，40μL NP40洗滌液）洗滌，各1缸，分別為10 min和5 min，70%乙醇浸泡3 min，自然干燥，滴加15 μL DAPI（聯(lián)咪二苯吲哚）復(fù)染劑，加蓋玻片，分析。

1.4 FISH信號分析 復(fù)染后的玻片用OLYMPUS B×51熒光顯微鏡在DAPI/FIFC/RHOD三色濾光鏡激發(fā)下，觀察間期細(xì)胞的熒光雜交信號。

1.5 閾值建立 20例正常宮頸組織活檢標(biāo)本，在100×10油鏡下觀察，每例隨機計數(shù)100個細(xì)胞。單個間期細(xì)胞核中紅綠信號比2：2為正常細(xì)胞；紅色信號＞2個，綠色信號≥2個判斷為陽性細(xì)胞。計算每例出現(xiàn)陽性細(xì)胞的百分比，建立閾值，閾值=平均數(shù)（x）+3×標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。本例閾值為8.66%，取整數(shù)9。

1.6 結(jié)果判定 100×10倍油鏡下觀察，每例隨機計數(shù)100個間期細(xì)胞，單個間期細(xì)胞核中紅綠信號比2∶2為正常細(xì)胞；紅色信號＞2個，綠色信號≥2個判斷為陽性細(xì)胞。記錄紅綠信號數(shù)hTERC：CSP3，陽性細(xì)胞個數(shù)≥閾值（本實驗為9個）為hTERC基因擴增陽性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計數(shù)資料比較采用 χ2檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸活檢正常組織中hTERC基因的擴增情況 宮頸活檢正常組織中hTERC基因偶爾可見擴增情況，大部分hTERC：CSP3呈2：2狀態(tài)，見圖1。

圖1 正常組織中hTERC基因的擴增情況

2.2 宮頸活檢高級別上皮內(nèi)瘤變（HSIL）區(qū)及其旁組織中hTERC基因的擴增情況 宮頸高級別上皮內(nèi)瘤變（HSIL）區(qū)、瘤變邊緣≤1 mm、1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm、2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm以及3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm的hTERC基因陽性率分別為100%、92.31%、87.18%、64.10%和30.77%，其中，HSIL與瘤變邊緣≤1 mm、1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.10，P＞0.05；χ2=3.20，P＞0.05）；HSIL與2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm、HSIL與3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm、1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm范圍與2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm、2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm與3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm范圍的比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意 義（χ2=17.06，P＜0.05； χ2=41.29，P＜0.05； χ2=5.64，P＜0.05； χ2=8.69，P＜0.05），見表1及圖2～11。

表1 宮頸活檢高級別上皮內(nèi)瘤變（HSIL）區(qū)及其旁組織中hTERC基因的陽性率比較

圖2 宮頸活檢HSIL區(qū)hTERC基因的擴增情況（FISH 100×10倍油鏡）

圖3 宮頸活檢HSIL區(qū)與其旁組織交界hTERC基因的擴增情況（HE 40×10）

圖4 宮頸活檢HSIL瘤變邊緣≤1 mm hTERC基因的擴增情況（FISH 100×10倍油鏡）

圖5 宮頸活檢HSIL瘤變邊緣≤1 mm hTERC基因的擴增情況（HE 40×10）

圖6 宮頸活檢HSIL區(qū)1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm hTERC基因的擴增情況（FISH 100×10倍油鏡）

圖7 宮頸活檢HSIL區(qū)1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm hTERC基因的擴增情況（HE 40×10）

2.3 宮頸活檢低級別上皮內(nèi)瘤變（LSIL）區(qū)及其旁組織中hTERC基因的擴增情況 宮頸低級別上皮內(nèi)瘤變（LSIL）區(qū)、瘤變邊緣≤1 mm、1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm、2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm以及3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm范圍的hTERC基因陽性率分別為41.67%、25.00%、4.17%、4.17%和 4.17%， 其 中，LSIL與瘤變邊緣≤1 mm、1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm與2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm、2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm 與3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.50，P＞0.05； χ2=0，P＞0.05； χ2=0，P＞0.05）， 而LSIL與1 mm＜瘤變邊緣≤2mm、LSIL與2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm、LSIL與3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm、瘤變邊緣≤1 mm與1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm的比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.55，P＜0.05； χ2=9.55，P＜0.05；χ2=9.55，P＜0.05； χ2=4.18，P＜0.05），見表2及圖12～21。

圖8 宮頸活檢HSIL區(qū)2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm hTERC基因的擴增情況（FISH 100×10倍油鏡）

圖9 宮頸活檢HSIL區(qū)2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm hTERC基因的擴增情況（HE 40×10）

圖10 宮頸活檢HSIL區(qū)3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm hTERC基因的擴增情況（FISH 100×10倍油鏡）

圖11 宮頸活檢HSIL區(qū)3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm hTERC基因的擴增情況（HE 40×10）

表2 宮頸活檢低級別上皮內(nèi)瘤變（LSIL）區(qū)及其旁組織中hTERC基因的陽性率的比較

圖12 宮頸活檢LSIL區(qū)hTERC基因的表達情況（FISH 100×10倍油鏡）

圖13 宮頸活檢LSIL區(qū)與其旁組織交界hTERC基因的表達情況（HE 40×10）

圖14 宮頸活檢LSIL區(qū)瘤變邊緣≤1 mm hTERC基因的表達情況（FISH 100×10倍油鏡）

3 討論

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與的、漫長而又復(fù)雜的過程，歷經(jīng)鱗狀上皮不典型增生、宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）等癌前病變過程。因此，對CIN進行有效的早期篩查、診治，是非常有必要的[12]。

目前宮頸癌的早期篩查主要依靠TCT和HPV檢測，但兩者的臨床應(yīng)用有一定局限性。細(xì)胞學(xué)檢查（TCT）是一種形態(tài)學(xué)檢查，受觀察者主觀因素的影響，有時難以做出正確診斷[13]；而針對HPV DNA的實驗也只能測出當(dāng)時HPV的狀態(tài)，大多數(shù)婦女特別是性生活活躍的年輕女性，HPV感染是暫時的，且HPV陽性不能反映細(xì)胞變異的狀態(tài)，使HPV陽性的預(yù)測意義較低，事實上ASCUS和輕度細(xì)胞學(xué)異常在年輕女性中很常見，但低度病變發(fā)展到宮頸癌的比率并不高。因此需要尋找其他檢測指標(biāo)以彌補這些檢測方法的不足。

圖15 宮頸活檢LSIL區(qū)瘤變邊緣≤1 mm hTERC基因的表達情況（HE 40×10）

圖16 宮頸活檢LSIL區(qū)1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm hTERC基因的表達情況（FISH 100×10倍油鏡）

圖17 宮頸活檢LSIL區(qū)1 mm＜瘤變邊緣≤2 mm hTERC基因的表達情況（HE 40×10）

圖18 宮頸活檢LSIL區(qū)2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm hTERC基因的表達情況（FISH 100×10倍油鏡）

圖19 宮頸活檢LSIL區(qū)2 mm＜瘤變邊緣≤3 mm hTERC基因的表達情況（HE 40×10）

圖20 宮頸活檢LSIL區(qū)3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm hTERC基因的表達情況（FISH 100×10倍油鏡）

圖21 宮頸活檢LSIL區(qū)3 mm＜瘤變邊緣≤4 mm hTERC基因的表達情況（HE 40×10）

近幾年，大量針對宮頸癌的研究表明，宮頸細(xì)胞癌變的過程中幾乎都伴有3號染色體3q26～3q27區(qū)域的擴增，而hTERC基因定位于該區(qū)域，提示，hTERC基因是與宮頸癌相關(guān)的一個重要基因[14]。熒光原位雜交（FISH）技術(shù)是一項分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，采用標(biāo)記單鏈核苷酸為探針，按照堿基互補配對原則，與待測未知單鏈核苷酸雜交，形成熒光顯微鏡下可見的熒光信號，近年來應(yīng)用日益廣泛[15-16]。FISH技術(shù)敏感性高、特異性好、定位準(zhǔn)確、結(jié)果直接清晰，是一項客觀有效的指標(biāo)，已被用于膀胱癌、乳腺浸潤癌等的基因檢測中。利用FISH技術(shù)來檢測宮頸脫落細(xì)胞和石蠟包埋組織細(xì)胞中hTERC基因的擴增也已被證實可行，且其陽性率隨宮頸病變分級的上升而逐漸增高[17-21]。

本研究應(yīng)用FISH技術(shù)檢測宮頸活檢組織細(xì)胞中hTERC基因的表達情況，不僅檢測病變部位組織的hTERC基因表達情況，而且利用測微尺，連續(xù)觀測及檢測距病變部位不同距離的組織中hTERC基因表達情況，以期證實：（1）隨著距瘤變部位的距離增加，hTERC基因的擴增是突然降低還是逐漸降低；（2）如果是隨著距瘤變區(qū)距離的增加，hTERC基因擴增逐漸減少，那么距瘤變區(qū)多少的距離處，hTERC基因表達降至與正常鱗狀上皮一致。

本研究中，應(yīng)用FISH技術(shù)檢測宮頸活檢組織細(xì)胞中hTERC基因的表達情況，利用測微尺連續(xù)觀察宮頸活檢高級別上皮內(nèi)瘤變（HSIL）區(qū)及其旁組織中hTERC基因的擴增情況，發(fā)現(xiàn)：（1）隨著距瘤變部位距離的增加，hTERC基因的擴增表達是逐漸下降的，即病變處hTERC基因的擴增100%表達，距病變區(qū)越遠(yuǎn)該基因的擴增率越小并逐漸達到正常，說明hTERC基因的擴增率與距瘤變部位的距離有相關(guān)性；（2）HSIL在距瘤變邊緣約2 mm處以外hTERC基因的表達下降至接近正常鱗狀上皮水平，其各范圍陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明2 mm以內(nèi)雖然HE染色鏡下觀察細(xì)胞已無明顯異型性，但是2 mm及以外是基因水平上較正常上皮，是否可以在HSIL術(shù)中將距病變2 mm作為安全的手術(shù)范圍仍是值得探討的問題；（3）對LSIL區(qū)及其旁組織中hTERC基因擴增情況的觀察表明，病變旁1 mm處兩側(cè)的組織中hTERC基因表達率有差異，即距病變部位邊緣約1 mm處該基因的表達率可能降至正常鱗狀上皮表達水平，其各范圍陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。雖然對LSIL患者不主張手術(shù)治療，但在臨床上常遇到患者h(yuǎn)TERC基因檢測表達率升高，患者因過分緊張、擔(dān)心而要求手術(shù)者，在這種情況下，將距病變1 mm作為安全的手術(shù)范圍也是值得探討的。

本實驗希望能為今后CIN手術(shù)在保證治療安全的前提下最大可能減少創(chuàng)傷，起到拋磚引玉的作用，為宮頸癌前病變的篩查、早期診斷及治療提供新的途徑。

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Expression Change and Significance of hTERC Gene by FISH Detection in CervicaI IntraepitheIiaI NeopIasia and Its Adjacent Tissues

/CAO Zhi-xing，LYU Wei，ZHAO Ye，et aI.//MedicaI Innovation of China，2014，11（23）：001-006

Objective：To detect the expression of the human telomerase （hTERC） gene of cervical intraepithelial neoplasia （CIN） and its adjacent tissues in cervical biopsy samples， to contrast and analyze the change of positive rate， to try to find the scope of surgical treatment on the CIN gene level.Method：The expression of hTERC gene was detected by FISH from 63 cases cervical biopsy specimen.ResuIt：Positive rate of expression of hTERC gene in high-grade squamous intraepithelial lesion （HSIL）， the range from the edge of neoplasia to ≤1 mm， 1 mm＜edge of neoplasia≤2 mm， 2 mm＜dge of neoplasia≤3 mm， 3 mm＜edge of neoplasia≤4 mm were 100%， 92.31%， 87.18%，64.10% and 30.77% respectively. Among them， the difference of HSIL and the range from the edge of neoplasia to ≤2 mm was not statistically significant（P＞0.05）. But the difference of HSIL and the range from the edge of neoplasia to ＞2 mm was statistically significant （ P＜0.05）.Positive rate of expression of hTERC gene in low-grade squamous intraepithelial lesion （LSIL）， the range from the edge of neoplasia to ≤ 1 mm， 1 mm＜edge of neoplasia≤ 2 mm，2 mm＜edge of neoplasia≤ 3 mm， 3 mm＜edge of neoplasia≤ 4 mm were 41.67%， 25.00%， 4.17%， 4.17% and 4.17% respectively. Among them， the difference of LSIL and the range from the edge of neoplasia to ≤1 mm was not statistically significant（ P＞0.05）. But the difference of LSIL and the range from the edge of neoplasia to ＞1 mm was statistically significant （P＜0.05）.ConcIusion：With the increase of range from the area of neoplasia， the positive rate of hTERC gene decreases obviously. The range from HSIL edge＞2 mm and LSIL edge＞1 mm may be the scope of surgical treatment on the CIN gene level， respectively（a more precise sense）.

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.23.001

2014-07-16） （本文編輯：蔡元元）

珠海市科技計劃項目（2011B040102003）

①廣東省珠海市第二人民醫(yī)院 廣東 珠海 519020

曹志星

【Key words】Fluorescence in situ hybridization； Cervical intraepithelial neoplasia； HTERC gene； Cervical biopsy samples； The scope of surgical treatment

First-author’s address：The Second PeopIe’s HospitaI of Zhuhai，Zhuhai 519020，China