增殖型糖尿病性視網膜病變動物模型的超微結構改變

董白霞，葉存喜，包永琴，魏玉華，崔月先，閻雪梅

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院眼科，國家級臨床重點專科，河北省眼病重點實驗室，河北 石家莊 050000)

作為糖尿病并發(fā)癥之一的糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)嚴重威脅患者的生存質量。近年來，國外研究多關注篩選藥物[1-2]，但是選擇動物模型更重要。以往的模型僅存在背景期病變，用于病因病機研究[3]；有的模型也發(fā)現增殖性糖尿病性視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)樣改變[4]，但周期長，應用受限；局部注射血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)[5]或重組VEGF腺病毒載體蛋白[6]的模型很難排除局部毒性作用。眾所周知，VEGF在DR的發(fā)生發(fā)展過程中起了主導作用。我們成功建立了一種理想的PDR動物模型[7]。本研究著重電鏡觀察該模型視網膜各層的超微結構損害，并與單純鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)腹腔注射的DR模型對比，明確其應用價值。

1 材料與方法

1.1 動物來源：選擇健康SD大鼠44只，8周齡，體質量180～250g，雌雄各半，購自河北省實驗動物中心。

1.2 分組：

1.2.1 糖尿病組：32只大鼠腹腔注射STZ；每周測血糖≥13.9mmol/L確定為糖尿病鼠，成模24只。未成模8只淘汰。再將24只糖尿病鼠分成2組。STZ傳統(tǒng)造模組糖尿病大鼠12只，腹腔注射STZ后1個月等量生理鹽水雙眼玻璃體注射。STZ聯合VEGF造模組糖尿病大鼠12只，腹腔注射STZ后1個月0.05μgVEGF(美國Sigma公司)雙眼玻璃體注射。

1.2.2 正常組：12只大鼠腹腔注射等量的生理鹽水。

以上模型制造后分析比較眼底熒光素血管造影、光鏡觀察視網膜血管滲漏情況及免疫組織化學CD105標記視網膜增殖血管內皮細胞，證實STA聯合VEGF造模組模型鼠具備PDR的特征[7]。

1.3 方法：對STZ聯合VEGF造模組、STZ傳統(tǒng)造模組不同病程取材進行視網膜組織病理學觀察，并與正常組對照。玻璃體注射生理鹽水或VEGF后2周、4周、8周、正常組時846復合麻醉劑(0.4mL/kg)肌內注射全麻后各取1只鼠眼視網膜做電鏡切片，觀察各組視網膜超微結構的改變。并進行比較，以明確STZ聯合VEGF造模組糖尿病大鼠PDR模型的應用價值。

2 結 果

視網膜組織病理學電鏡觀察結果如下。

2.1 正常組：色素上皮細胞胞漿內可見初級和次級溶酶體、線粒體及少量色素顆粒，視細胞外節(jié)膜盤排列整齊，無碎裂、溶解現象；內核層由外向內依次分布著水平細胞、雙極細胞和無長突細胞，雙極細胞體積較大，核大質少，核內染色質分布均勻；神經節(jié)細胞體積最大，單行排列形成視網膜最內層細胞(圖1A)。

2.2 2周時STZ傳統(tǒng)造模組：視細胞內節(jié)內線粒體腫脹，滑面內質網擴張(圖1B)。

2.3 4周時STZ傳統(tǒng)造模組：視細胞外節(jié)膜盤排列紊亂，部分碎裂、溶解(圖1C)；雙極細胞胞漿內線粒體腫脹。

2.4 8周時STZ傳統(tǒng)造模組：色素上皮細胞微絨毛少、短，胞漿內無脂滴；內網層神經細胞突起內局部輕水腫，輕于8周時STZ聯合VEGF造模組 (圖1D)。神經節(jié)細胞內粗面內質網擴張、線粒體空泡化。

2.5 2周時STZ聯合VEGF造模組:視細胞內節(jié)胞質內線粒體空泡化，內質網擴張、空泡化(圖2A);雙極細胞核膜外層溶解、線粒體腫脹、胞漿水腫;內網層空泡變；神經節(jié)細胞內線粒體及滑面內質網擴張、空泡化，胞漿液化、溶解。

2.6 4周時STZ聯合VEGF造模組：視細胞外節(jié)膜盤溶解較重(圖2B)，但內節(jié)尚有部分殘留；視桿、視錐細胞外間隙水腫較2周時STZ聯合VEGF造模組嚴重，細胞核外膜部分斷裂；內核層雙極細胞胞漿水腫，可見線粒體空泡化、溶解，滑面內質網擴張，粗面內質網無明顯擴張。

2.7 8周時STZ聯合VEGF造模組：視桿及視錐層溶解、消失；內、外核層變薄；可見到碎裂的視桿細胞胞核固縮(圖2C)；外網層消失；內網層空泡化，胞漿液化、水腫，樹突內線粒體腫脹、空泡化(圖2D)；神經節(jié)細胞胞質液化、溶解，線粒體、滑面內質網空泡化，粗面內質網輕度擴張。病變重于4周時STZ聯合VEGF造模組。

圖1 正常組及STZ傳統(tǒng)造模組糖尿病大鼠視網膜電鏡結構改變

A.正常組視細胞外節(jié)膜盤排列整齊，無碎裂和溶解(×8 000);B.2周時STZ傳統(tǒng)造模組光感受器細胞內線粒體腫脹，滑面內質網擴張(×10 000);C.4周時STZ傳統(tǒng)造模組視細胞外節(jié)膜盤排列紊亂，部分碎裂、溶解(×8 000);D.8周時STZ傳統(tǒng)造模組內網層神經細胞突起內水腫程度輕于8周時STZ聯合VEGF造模組(×6 000)

圖2 STZ聯合VEGF造模組糖尿病大鼠電鏡結構改變

A.2周時視細胞內外節(jié)連接處(×20 000);B.4周時外節(jié)膜盤嚴重溶解(×6 000);C.8周時外核層溶解、消失，內外核層變薄，外網層消失(×3 000)；D.8周時內網層空泡化，胞漿液化、水腫，胞體樹突內線粒體腫脹、空泡化(×3 000)

3 討 論

常用的DR動物模型有以下5種：自發(fā)性遺傳性糖尿病動物模型、化學物質誘導糖尿病動物模型[8]、胰腺切除糖尿病動物模型、半乳糖喂養(yǎng)誘導DR動物模型、VEGF局部注射DR動物模型。均可模擬背景型DR，但PDR很難出現[9]。

單純局部注射VEGF造模方法忽略了血糖升高的過程，沒有在造成糖尿病的基礎上局部注射VEGF，很難模擬DR的發(fā)生發(fā)展過程。更為重要的是，視網膜出現病變的時間較短，不能排除其視網膜病變是由于VEGF局部高劑量或高濃度應用對視網膜血管組織所致的毒性反應。

董宇等[10]應用Wistar大鼠腹腔注射STZ 40mg/kg后給予高糖、高脂飼料喂養(yǎng)4周僅僅出現了毛細血管基底膜增厚、斷裂缺失、電子密度不均；內皮細胞腫脹變形，核形態(tài)不規(guī)則，異染色質靠邊聚集，線粒體空化，嵴斷裂；周細胞線粒體腫脹變形、空化。基于上述原因，我們在前期研究中成功建立了PDR動物模型[7]，為了進一步描述模型的可靠性，本研究主要觀察其超微結構的改變，以驗證其應用價值。

本研究結果顯示，2周時STZ傳統(tǒng)造模組視細胞內節(jié)內線粒體腫脹、滑面內質網擴張，其余各層接近正常。2周時STZ聯合VEGF造模組出現多層結構的損傷，視細胞內節(jié)胞質內線粒體空泡化，內質網擴張、空泡化;雙極細胞核膜外層溶解、線粒體腫脹、胞漿水腫;神經節(jié)細胞內線粒體及滑面內質網擴張、空泡化，胞漿液化、溶解。4周時STZ傳統(tǒng)造模組視細胞外節(jié)膜盤排列紊亂，部分碎裂、溶解；雙極細胞胞漿內線粒體腫脹。4周時STZ聯合VEGF造模組視細胞外節(jié)膜盤溶解較重，但內節(jié)尚有部分殘留；視桿、視錐細胞外間隙水腫較2周時STZ聯合VEGF造模組嚴重，細胞核外膜部分斷裂；內核層雙極細胞胞漿水腫，可見線粒體空泡化、溶解，滑面內質網擴張，粗面內質網無明顯擴張。8周時STZ傳統(tǒng)造模組色素上皮細胞微絨毛少、短，胞漿內無脂滴；內網層神經細胞突起內局部輕水腫，較8周時STZ聯合VEGF造模組輕，神經節(jié)細胞內粗面內質網擴張，線粒體空泡化；8周時STZ聯合VEGF造模組視桿及視錐層溶解、消失，內、外核層變薄，可見到碎裂的視桿細胞胞核固縮，外網層消失，胞漿液化、水腫，樹突內線粒體腫脹、空泡化，神經節(jié)細胞胞質液化、溶解，線粒體、滑面內質網空泡化，粗面內質網輕度擴張，病變重于4周時STZ聯合VEGF造模組。由此可見，STZ聯合VEGF造模組視網膜各層組織超微結構的損害明顯重于STZ傳統(tǒng)造模組；2、4、8周時STZ聯合VEGF造模組之間比較，4周時病變明顯重于8周，而8周時STZ聯合VEGF造模組出現了視網膜萎縮的改變。表明聯合注藥的造模方法不僅可以出現PDR，還可以縮短研究周期，是一種適合于臨床藥物篩選的理想動物模型。

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