鹽酸戊乙奎醚對膿毒癥大鼠預后的影響

楊 強，常玉林，李 蕾，劉朝輝

(1.河北省滄州市中心醫院麻醉科，河北 滄州 061000;2.河北省滄州市中心醫院體檢中心，河北 滄州 061000)

膿毒癥引起的全身炎癥反應綜合征是嚴重燒傷、感染、創傷患者的主要死因[1]。最近幾年許多臨床治療方法包括抗炎策略和液體替換用于治療膿毒癥[2-3]，然而這些方法的有效性并沒有很大進展，因此尋找新的臨床干預方法顯得十分重要。有報道[4]高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1，HMGB1)是一個非組氨酸核蛋白，在膿毒癥發生機制中是一個重要晚期炎癥介質[5]。拮抗HMGB1治療在許多臨床前炎癥疾病模型上有良好效果[6]。鹽酸戊乙奎醚(penehyclidine hydrochloride，PHC)可以抑制炎癥反應和降低內毒素休克大鼠病死率[7]。本研究旨在探討PHC對膿毒癥病死率、重要器官功能和HMGB1表達的效果。

1 材料與方法

1.1 材料：48只健康雄性清潔級Wistar大鼠，體質量250～300g，由河北省實驗動物中心提供。Trizol(Invitrogen公司，美國)；大鼠HMGB1酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(上海滬尚生物科技公司)；大鼠HMGB1和GAPDH擴增引物(上海英俊公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立：所有大鼠在手術前12h空腹，隨后腹腔注射10%水合氯醛(0.4mL/100g)并背側臥位固定。大鼠膿毒癥模型用盲腸結扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)制備,一條1.5cm切口沿著盲腸根部和腹中線切開。盲腸壁穿刺3次沿著結扎側用18號針，隨后進行引流以阻止穿刺孔被腸內容物堵塞。腸管放回腹腔隨后縫合腹膜腔和皮膚。對照組僅進行腹部切開，盲腸分離和腹腔關閉。所有大鼠快速皮下注射生理鹽水按照術后3mL/100g給予。

1.2.2 動物分組：上述麻醉和固定后在CLP之前進行右頸內靜脈分離，隨后成功置入頸內靜脈24G套管針，套管針與微量注射泵相連。隨機分為4組，每組12只，包括對照組(C組)、模型組(CLP組)、早期PHC處理組(PHC+CLP組)和晚期PHC處理組(CLP+PHC組)。C組用生理鹽水替代PHC。PHC+CLP組在CLP前1h給予靜脈注射PHC(0.45mg/kg)；CLP+PHC組在CLP后1h給予靜脈注射PHC(0.45mg/kg)。觀察大鼠的臨床表現。每組大鼠分別在CLP后24h和48h處死收集樣本。

1.2.3 標本處理：在大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，從心臟采集5mL血樣，以3 000r/min離心10min。收集血清然后用乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)處理。100mg肺組織和收集的血清儲存于-80℃待測。

1.2.4 檢測血清中HMGB1水平：血清中HMGB1水平用ELISA試劑盒進行檢測，按照試劑盒說明書操作(上海滬尚生物科技公司,上海)。

1.2.5 檢測CLP 24h后血清中生化參數:血清中丙氨酸轉氨酶(alanine transferase,ALT)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate transaminase,AST)，尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)，肌酐(creatinine，Cr)和肌酸磷酸激酶(creatine kinase,CK)用自動生化分析儀檢測。

1.2.6 檢測肺組織中HMGB1 mRNA表達：100mg肺組織制成勻漿后，總RNA用Trizol(Invitrogen公司，美國)進行一部提取法抽提，并且隨后RNA濃度用紫外分光光度計進行檢測。逆轉錄用2μg總RNA獲得cDNA,作為實時熒光定量PCR的模板。GAPDH作為內部參考基因和HMGB1作為靶基因獲得HMGB1和GAPDH在GeneBank的信使RNA序列。特異性引物用Prime5軟件設計并且由上海英俊生物科技公司合成(上海，中國)。HMGB1基因序列(158bp)，上游序列為5′-CCATTGGTGATGTTGCAAAG-3′，下游序列為5′-CTTTTTCGCTGCATCAGGTT-3′。GAPDH基因序列，上游序列為5′-CAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3′，下游序列為5′-TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC-3′。實時熒光定量PCR在25μL容積體系進行，體系含有0.5μL(10mmol/L)上游和下游引物。12.5μL 2倍SYBR Green Mix和雙蒸水。擴增條件為預變性在95℃ 2min；94℃15s，58℃15s，72℃15s，40循環；收集熒光在72℃。Ct值獲得用于統計HMGB1 mRNA的相對表達量和HMGB1與GAPDH基因的比例。

2 結 果

2.1 一般情況和病死率：在CLP組大鼠出現行動遲緩、食欲減低、嗜睡、豎毛、腹瀉和眼分泌物增多。隨著膿毒癥的進展發生窒息并且一些大鼠死亡。尸檢顯示在腹腔中有更多血和化膿性滲出，腸管擴張和黑色腫大的盲腸。在CLP后48h，CLP組、PHC+CLP組和CLP+PHC組的死亡數分別是8、3和4只。顯示CLP具有明顯的致死效果，PHC可以顯著改善生存率，C組無死亡大鼠，CLP組大鼠生存率低于PHC+CLP組和CLP+PHC組(P<0.05)。見表1。

2.2 PHC對血清中HMGB1和肺組織HMGB1 mRNA表達的影響:在膿毒癥模型建立后24h和48h，CLP組的HMGB1水平和HMGB1 mRNA表達均高于C組(P<0.01)；PHC+CLP組和CLP+PHC組均比CLP組明顯降低(P<0.01)，PHC+CLP組比CLP+PHC組降低的更多。48h與24h比較，只有PHC+CLP組HMGB1 mRNA表達有明顯降低(P<0.01)；其余指標兩時間點之間差異均無統計學意義。見表2。

Groups48h surviveC12(100.0)CLP4(33.3)PHC+CLP9(75.0)?CLP+PHC8(66.7)? χ212.703 P0.005

*P<0.05vsC group by χ2test

CLP:cecal ligation and puncture;PHC:penehyclidine hydrochloride

GroupsHMGB1(mg/L)24h48hHMGB1 mRNA(OD)24h48hC4.5±0.44.8±0.50.53±0.150.46±0.02CLP14.2±1.3?13.8±1.2?2.91±0.17?2.31±0.70?PHC+CLP9.1±1.1?#△8.7±0.9?#△1.75±0.03?#△1.47±0.17?#△☆CLP+PHC11.9±1.1?#10.8±1.2?#1.96±0.06?#1.59±0.11?# F195.925174.244411.08826.187 P0.0000.0000.0000.000

*P<0.01vsC group #P<0.01vsCLP group △P<0.05vsCLP+PHC group byqtest ☆P<0.01vs24h byttest

CLP:cecal ligation and puncture;PHC:penehyclidine hydrochloride

2.3 PHC對CLP后24h血清中ALT、AST、BUN、Cr和CK的影響：與C組相比，血清中ALT、AST、BUN、Cr和CK在CLP組、PHC+CLP組和CLP+PHC組顯著增加(P<0.05)。與CLP組相比，血清中ALT、AST、BUN、Cr和CK在PHC+CLP組和CLP+PHC組均降低(P<0.05)。見表3。

GroupsALT(U/L)AST(U/L)BUN(mmol/L)Cr(mmol/L)CK(U/L)C43.3±4.7150.1±18.25.8±1.022.6±3.1235.8±25.2CLP215.1±31.1?590.4±102.0?21.6±3.7?58.2±9.0?833.5±152.6?PHC+CLP101.1±15.2?#340.3±57.7?#13.5±2.1?#45.6±5.3?#551.9±123.7?#CLP+PHC123.9±22.6?#372.8±61.4?#11.8±2.7?#48.3±7.4?#510.8±112.5?# F70.69043.80238.96331.37227.674 P0.0000.0000.0000.0000.000

*P<0.05vsC group #P<0.05vsCLP group byqtest

CLP:cecal ligation and puncture;PHC:penehyclidine hydrochloride

2.4 相關性分析：血清中HMGB1與肺組織中HMGB1 mRNA呈顯著正相關(r=0.945，P<0.01)。

3 討 論

CLP誘發膿毒癥休克大鼠模型并且應用到本研究的模型也稱混合性膿毒癥模型。與脂多糖誘發的內毒素休克模型相比，CLP模型可以反映更多臨床上膿毒癥休克的典型特征。觀察本研究中大鼠的臨床表現，應用到本研究的膿毒癥模型是成功的。資料顯示CLP后早期病死率高達50%[8]。目前PHC主要用于麻醉術前用藥，所以本研究觀察CLP后48h大鼠的生存率。結果顯示PHC可以明顯改善CLP后大鼠生存率，與文獻報道的PHC顯著增加內毒素休克大鼠生存率一致[7]。

HMGB1是一種非組氨酸蛋白，作為一個新的潛在的晚期炎性介質參與膿毒癥的發病機制，并被認為是最重要的晚期炎性介質，它在膿毒癥中具有致死效果[9]。Shao等[10]報道了血清中HMGB1表達水平與試驗性動物膿毒癥進展和嚴重性密切相關。本研究結果顯示，與對照組相比，CLP組和PHC組HMGB1在相同時間點血清中和肺組織中顯著增加(P<0.05)；隨后給予PHC，HMGB1水平在PHC組低于CLP組；早期PHC處理組比晚期PHC處理組在相同時間點血清中HMGB1和肺組織中HMGB1 mRNA表達更低；并且血清中HMGB1與肺組織中HMGB1 mRNA呈正相關(r=0.945)。表明PHC可以通過抑制血清和肺組織中HMGB1在膿毒癥中扮演重要角色，改善膿毒癥大鼠的預后，并且早期PHC干預效果更好。

對于膿毒癥患者經常合并多器官功能衰竭的，一個重要的臨床選藥原則是這個藥物是否會對重要器官產生保護效果。本研究結果顯示，與CLP組相比，PHC+CLP組和CLP+PHC組在CLP后24h血清中ALT、AST、BUN、Cr、CK水平明顯降低，顯示PHC對膿毒癥大鼠重要器官具有保護效果。許多研究顯示巨噬細胞和其他免疫細胞在各種休克和膿毒癥模型中是重要的促炎細胞因子來源。祝春華等[11]報道庫普弗細胞被認為是膿毒癥急性期促炎因子的一個主要來源。在本研究中PHC是否通過特異性庫普弗細胞反映具有肝臟保護效果仍有待進一步研究，如PHC對膿毒癥大鼠重要器官保護效果的具體機制如何？PHC參與的保護效果與HMGB1的關系如何？這是我們研究的局限性。PHC抑制HMGB1水平的機制尚不十分清楚，但可能與下列因素有關，PHC可以降低膿毒癥動物一氧化氮(nitric oxide,NO)水平，NO可以產生對血管內皮細胞的損害，并且NO與HMGB1密切相關[12]；PHC可以降低膿毒癥大鼠肝臟細胞核因子κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)活性，抑制TNF-α等促炎細胞因子水平，具有抗炎作用；PHC可以抑制過氧亞硝酸陰離子(peroxynitrite,ONOO-)活性，來阻斷內皮細胞內ONOO-介導的NF-κB核轉移，部分抑制NF-κB活性導致的炎性級聯反應信號擴增。NF-κB參與HMGB1/RAGE信號傳導，所以抑制NF-κB活性可以導致HMGB1降低。

總之，膿毒癥大鼠血清中HMGB1與肺組織中HMGB1 mRNA密切相關。PHC可以抑制HMGB1和HMGB1 mRNA，并且明顯改善膿毒癥大鼠的生存率。PHC在改善膿毒癥大鼠預后上扮演重要角色。與此同時，PHC對膿毒癥大鼠的肝、腎和心臟具有保護效果。本研究對膿毒癥或膿毒性休克患者的治療提供了新的選擇。然而，尚需進一步研究PHC在膿毒癥中扮演抗炎角色的具體機制。

[1] MARTIN GS,MANNINO DM,EATON S,et al.The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000[J].N Engl J Med,2003,348(16):1546-1554.

[2] COHEN S,HURD E,CUSH J,et al.Treatment of rheumatoid arthritis with anakinra,a recombinant human interleukin-1 receptor antagonist,in combination with methotrexate:results of a twenty-four-week,multicenter,randomized,double-blind,placebo-controlled trial[J].Arthritis Rheum,2002,46(3):614-624.

[3] EICHACKER PQ,PARENT C,KALIL A,et al.Risk and the efficacy of antiinflammatory agents: retrospective and confirmatory studies of sepsis[J].Am J Respir Crit Care Med,2002,166(9):1197-1205.

[4] SCAFFIDI P,MISTELI T,BIANCHI ME.Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation[J].Nature,2002,418(6894):191-195.

[5] WANG H,YANG H,CZURA CJ,et al.HMGB1 as a late mediator of lethal systemic inflammation[J].Am J Respir Crit Care Med,2001,164(10 Pt 1):1768-1773.

[6] YANG H,TRACEY KJ.Targeting HMGB1 in inflammation[J].Biochim Biophys Acta,2010,1799(1/2):149-156.

[7] ZHANG J,WANG Y，WANG C,et al.Protective effects of penehyclidine hydrochloride on septic mice and its mechanism[J].Shock,2007,28(6):727-732.

[8] WEISS YG,BELLIN L,KIM PK,et al.Compensatory hepatic regeneration after mild,but not fulminant,intraperitoneal sepsis in rats[J].Am J Physiol Gastroint Liver Physiol,2001,280(5):G968-973.

[9] LOTZE MT,TRACEY KJ.High-mobility group box 1 protein (HMGB1): nuclear weapon in the immune arsenal[J].Nat Rev Immunol,2005,5(4):331-342.

[10] SHAO YM,YAO HG,LIANG XZ,et al.Relation between level of expression of high mobility group protein B1 in hepatic tissue with the severity and prognosis of sepsis in rat[J].Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue,2006,18(11):668-672.

[11] 祝春華,溫雅,王力娜，等.替米沙坦對大鼠腦缺血后核因子κB表達的影響[J].河北醫科大學學報,2013,34(5):497-500.

[12] DEGRYSE B,BONALDI T,SCAFFIDI P,et al.The high mobility group (HMG) boxes of the nuclear protein HMG1 induce chemotaxis and cytoskeleton reorganization in rat smooth muscle cells[J].J Cell Biol,2001,152(6):1197-1206.