Nrf2、NQO1在腎透明細胞癌中的表達及意義

高 強，許 鵬，郭巖松，馮騰飛，黎 瑋

(河北醫科大學第二醫院泌尿外科，河北 石家莊 050000)

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系統常見的惡性腫瘤，發病率及病死率呈逐年上升趨勢，而其中60%～85%為透明細胞癌[1]。腎透明細胞癌(renal clear cell carcinoma，RCCC)惡性程度較高，容易發生遠處轉移，且對放化療不敏感[2]。因此，探討RCCC的發生和發展機制對其診斷、治療、預后等方面具有重要價值。核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor，Nrf2)是抗氧化應激轉錄因子(cap-n-cohar，CNC)轉錄因子家族中調節抗氧化應激反應的重要轉錄因子，醌氧化還原酶(triphosphopyridine nucleotide quinine oxidoreductase，NQO1)是Nrf2/抗氧化反應元件(anti-oxidant response elermenty,ARE)抗氧化應激系統中下游表達蛋白[3]。研究[4]表明，Nrf2/NQO1信號通路在呼吸、消化、神經、心血管系統等多種器官的氧化應激反應中發揮重要作用，而Nrf2、NQO1表達水平及其活性變化與腫瘤的發生和發展有密切關系。但Nrf2、NQO1在RCCC中的表達目前尚無報道。本研究觀察Nrf2、NQO1蛋白和mRNA在RCCC組織和癌旁組織中的表達情況，探討其在RCCC發生、發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集2012年1月—2013年1月于河北醫科大學第二醫院泌尿外科住院行RCCC手術的患者52例，男性31例，女性21例，年齡37～82 歲，平均(56.13±13.98)歲。均已經過病理證實為RCCC，所有患者術前均未行放療、化療及其他非手術治療。對照腎組織21例為癌旁>4cm的腎組織(病理學證實)。標本分為2份，1份以10%福爾馬林固定，常規包埋、切片，另1份標本收集后立即以液氮進行快速冷凍并保存在-80℃冰箱中。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑：Nrf2兔多克隆抗體(1∶100稀釋)和NQO1山羊多克隆抗體(1∶150稀釋)(Santa Cruz公司)；Trizol試劑盒(Invitrogen公司)，焦碳酸二乙酯(Sigma公司)，逆轉錄、PCR試劑盒和DNA標記物(TaKaRa公司)，引物由Invitrogen公司設計合成。

1.2.2 免疫組織化學檢測及結果判定：52例RCCC及21例癌旁組織采用免疫組織化學檢測，嚴格按照試劑盒使用程序進行。DAB顯色，蘇木精復染，逐級脫水，中性樹脂封片。以PBS液代替一抗作為陰性對照。以胞漿或胞核內出現黃色或者棕黃色顆粒為陽性表達判定標準，每張切片在顯微鏡下隨機選取10個視野，每個視野均計數100個細胞，結合表達情況應用改進的雙評分半定量法評分，0～15%計為0分,>15%～30%計為1分，>30%～50%計為2分，>50%～80%計為3分，>80%～100%計為4分； 細胞未著色記作0分，淡黃色記作1分，黃色或棕黃色記作2分，棕黃色記作3分。2種計分相乘，得分0～3分作為陰性(-)表達，得分4～12分作為陽性(+)表達。

1.2.3 逆轉錄聚合酶鏈反應半定量分析：36例RCCC及14例癌旁組織采用RT-PCR檢測。引物序列，Nrf2上游引物5′-TATAGCGTG CAAAC CT CGCC-3′，下游引物5′-AAGTGACTGAAACGTAG-CCG-3′，擴增片段為550bp；NQO-1上游引物5′-AGGACCCTTCCGGAGTAAGAA-3′，下游引物5′-GTCAGGGAAGCCTGGAAAGA-3′，擴增片段為 488bp；β-actin上游引物5′-CTTCCAGCCTTCCTTCC-TGG-3′，下游引物5′-TTCTGCATCCTGTCGGCAAT-3′，擴增片段為162bp。按照Trizol試劑使用說明書提取冰凍組織中的RNA，檢測其濃度及純度，用PE基因擴增儀行逆轉錄并擴增，并行瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker(DL2000)為標準片段作標記，應用紫外透射儀觀察并用數碼相機照相電泳后條帶，并應用Quantity One凝膠圖像分析軟件分析目的電泳條帶，參照相應的內參電泳條帶，結果以兩者積分吸光度的比值表示。

2 結 果

2.1 組織化學檢測結果：在RCCC組織及其癌旁組織中均有Nrf2、NQO1蛋白表達。RCCC組織中Nrf2蛋白、NQO1蛋白主要存在于細胞質和細胞核中，為黃色或棕黃色顆粒。癌旁組織中Nrf2蛋白、NQO1蛋白主要存在于細胞質中，為淡黃色顆粒(圖1，2)。Nrf2蛋白在RCCC組織表達明顯高于癌旁組織，陽性表達率分別為76.9%和28.6%，差異有統計學意義(χ2=15.005，P<0.01)；NQO1蛋白在RCCC表達亦高于癌旁組織，陽性表達率分別73.1%和23.8%，差異有統計學意義(χ2=14.999，P<0.01)。Nrf2與NQO1蛋白在RCCC組織中表達呈正相關(rs=0.594，P<0.05)。見表1，2。

2.2 RT-PCR結果：瓊脂糖凝膠電泳顯示，550bp為Nrf2目的條帶，488bp處為NQO1目的條帶，162bp處為內參目的條帶。半定量分析結果顯示，RCCC中Nrf2和NQO1mRNA相對表達量分別為0.767±0.125和1.025±0.148，而在在癌旁組織中的相對表達量為分別為0.299±0.025和0.181±0.051，即RCCC組織中Nrf2和NQO1mRNA相對表達量顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義(t=22.807、16.197,P<0.05)。

表1 Nrf2和NQO1蛋白在癌旁組織和RCCC組織的表達Table 1 Expression of Nrf2 and NQO1 protein in RCCC and pericarcinomatous tissues (n，%)

Nrf2：nuclear factor E2-related factor；NQO1：triphosphopyridine nucleotide quinine oxidoreductase

表2 Nrf2和NQO1在RCCC表達的相關性Table 2 Correlation between the expression of Nrf2 and NQO1 in RCCC (n，%)

Nrf2：nuclear factor E2-related factor；NQO1：triphosphopyridine nucleotide quinine oxidoreductase

3 討 論

機體內各種應激因素在腫瘤細胞生長過程中持續出現，從而使機體發生氧化應激即內源性應答反應，輕度氧化應激可使細胞發生適應性變化如存活、增殖、分化等，而重度氧化應激則可能造成細胞的損傷性變化如增殖異常、增殖阻滯、衰老、凋亡和壞死等，從而導致腫瘤等一些疾病的發生[5-6]。Nrf2是人體完整的內源性應答反應即抗氧化系統的核心轉錄調節因子，作為感受器感受氧化應激，是細胞內對抗氧化應激最重要的機制[3-4]。在正常情況下，Nrf2以異源二聚體的形式與其抑制物Kelch樣ECH相關蛋白(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)存在于細胞質中，一些因素使其激活后，二者即發生分離，轉位進入細胞核，調節下游抗氧化酶基因NQO1的表達，引起氧化應激和還原循環的活性醌類及其衍生物抗氧化及解毒[3-4]。Kim等[7]研究發現，腎細胞中氧化應激、炎癥反應和Nrf2活性損害引起抗氧化酶和解毒酶的表達下調。表明在腫瘤的形成和細胞增殖過程中，與氧化應激反應和炎癥反應關系密切。而目前已有研究[3-8]發現多種藥物的抗氧化及抗炎作用是通過Nrf2/ NQO1信號通路實現的。對甲狀腺癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌等惡性腫瘤的研究[8-10]發現Nrf2的轉錄激活和表達水平上調。提示Nrf2/NQO1的抗氧化效應在腫瘤的發展過程中扮演著重要角色。

本研究從蛋白水平及mRNA水平檢測了Nrf2和NQO1在RCCC組織和癌旁組織中的表達情況，初步證實Nrf2和NQO1在RCCC中的表達升高，同時Nrf2與NQO1呈正相關，這一結果與Nrf2和NQO1在其他惡性腫瘤中的表達情況基本一致[8-10]。由此推測，Nrf2和NQO1在RCCC細胞氧化應激反應中發揮了重要作用，通過激活該通路，誘導Nrf2高表達，促進NQO1表達，使細胞對氧化應激的耐受性增強，進而可能在RCCC的發生發展中起作用。因此，Nrf2和NQO1信號通路有望成為治療RCCC的新靶位，將為RCCC的早期檢測和治療開辟新的道路。(本文圖見封二)

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