連錢(qián)草總黃酮提取工藝優(yōu)化

1.湖北民族學(xué)院生科院，湖北 恩施 445000；2.南京同仁堂洪澤中藥材科技有限公司，江蘇 洪澤 223200；3.南京醫(yī)藥股份有限公司博士后工作站，江蘇 南京 210012

連錢(qián)草為唇形科活血丹屬植物活血丹[Glechomalongituba(Nakai) Kupr.]干燥地上部分。連錢(qián)草性味涼辛，微苦，微寒。歸肝、腎、膀胱經(jīng)[1]，具有利膽、利尿、抗菌、抗炎、降血糖、抗腫瘤以及抗腹瀉等藥理作用，主治黃疸型肝炎、膽囊炎、膽石癥、疳積、腎結(jié)石、膀胱結(jié)石、多發(fā)性膿瘍、瘡癰腫痛、嬰兒濕疹、跌打損傷、腮腺炎、牙痛等癥[2]。

連錢(qián)草的主要化學(xué)成分有萜類[3]、黃酮[4,5]、揮發(fā)油[6]、有機(jī)酸[7,8]以及多糖等。其中，萜類化合物主要包括熊果酸、齊墩果酸、烏蘇酸、2-羥基烏蘇酸等；黃酮和黃酮苷類化合物包括木犀草素、蘆丁、芹菜素、刺槐素、海常素、胡蘿卜苷、槲皮素、連錢(qián)草酮等；揮發(fā)油類化合物包括左旋薄荷酮、胡薄荷酮、旅烯、檸檬烯、1,8-桉葉素、異薄荷酮、異松樟酮、α-松油醇等，具有特殊的清香味；有機(jī)酸類化合物包括阿魏酸、咖啡酸、介子酸、月桂酸、迷迭香酸、原兒茶醛、迷迭香酸甲酯、三十烷酸、肉豆蔻酸等有機(jī)酸。

目前針對(duì)連錢(qián)草總黃酮提取工藝的研究尚不多見(jiàn)。本研究通過(guò)考察提取時(shí)間、提取溫度、液固比和乙醇等因素，采用單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化了連錢(qián)草總黃酮的提取工藝，結(jié)果理想，報(bào)告如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、RT-02A型多功能粉碎機(jī)(弘荃機(jī)械企業(yè)有限公司)、BECKMAN COUCTER型離心機(jī)(美國(guó)BECKMAN公司)、HHS型恒溫水浴鍋等儀器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.2 試藥 連錢(qián)草由南京同仁堂洪澤中藥材科技有限公司提供(經(jīng)姜寧副教授鑒定為唇形科活血丹屬植物活血丹[Glechomalongituba(Nakai) Kupr.])，烘干，粉碎，過(guò)60目篩；無(wú)水乙醇、蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃酮含量的測(cè)定 以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用 Design-Expert 8.0的Box-Behnken 設(shè)計(jì)，以提取時(shí)間、溫度、液固比、乙醇濃度為自變量，黃酮提取率為響應(yīng)值。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)和結(jié)果分別見(jiàn)表1、表2。

表1 因素水平編碼

表2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，建立了如下回歸模型：R=6.38-0.16A+0.057B+0.44C+0.11D+0.15AB+0.11AC+0.62AD+0.36BC+0.030BD+0.013CD-0.63A2-0.61B2-0.85C2-0.54D2。該回歸模型的決定系數(shù)R2為0.9746，校正后的決定系數(shù)(adj-R2)為0.9493，說(shuō)明該模型擬合性較好。對(duì)回歸模型和各因子進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可知：該模型F值為38.41，P值<0.0001，而失擬性試驗(yàn)F值為2.19，不顯著，說(shuō)明此模型與實(shí)際情況擬合得較好。根據(jù)F值和P值，可以得出各因素對(duì)響應(yīng)值的作用由大到小為：C2>A2>B2>C>D2>AD>BC>A>D>AB>AC>B>BD>CD。其中：B、AB、AC、BD、CD對(duì)響應(yīng)值的作用不顯著，所以上述回歸方程中以上幾項(xiàng)可以忽略，所得回歸方程如下：R=6.38-0.16A+0.44C+0.11D+0.62AD+0.36BC-0.63A2-0.61B2-0.85C2-0.54D2。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果方差分析表

2.2.2 優(yōu)化工藝的確定 由Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果所得的回歸方程，可以計(jì)算出當(dāng)A=-0.05，B=0.13，C=0.28，D=0.08時(shí)，R有極大值6.45%。將各因素的水平回代，可以得到最優(yōu)工藝是提取時(shí)間1.4975h，41.3℃，液固比22.8∶1，乙醇濃度90.4%時(shí)，黃酮提取率最高。為了操作方便，將優(yōu)化的工藝確定為提取時(shí)間1.5h，提取溫度41℃，液固比23∶1，乙醇濃度90%，并對(duì)該工藝進(jìn)行了驗(yàn)證，連錢(qián)草黃酮提取率在6.32%～6.47%之間。說(shuō)明經(jīng)過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化的工藝具有很強(qiáng)的實(shí)踐指導(dǎo)作用。

2.2.3 響應(yīng)面分析 圖1為響應(yīng)面分析。從中可以看出：當(dāng)C=0.28，D=0.08時(shí)，黃酮的提取率隨著A和B的增加而上升，當(dāng)達(dá)到最大值后，A和B的上升反而會(huì)使提取率下降(圖1A)；B和D分別為0.13、0.08時(shí)，A和C處于低水平時(shí)，響應(yīng)值較低，隨著A和C的升高，響應(yīng)值也隨之升高，當(dāng)?shù)揭欢ǔ潭群螅憫?yīng)值不再隨A和C的上升而上升，而是下降(圖1B)；如B=0.13、C=0.28，A和D的變化會(huì)顯著影響黃酮的提取率，當(dāng)A和D較小時(shí)，黃酮提取率也較低，當(dāng)A和D增大后，提取率也增高，當(dāng)提取率達(dá)到極大值后，其會(huì)隨著A和D的上升而下降(圖1C)；圖1D顯示了B和C對(duì)響應(yīng)值的影響，響應(yīng)值開(kāi)始隨著B(niǎo)和C的上升而上升，當(dāng)達(dá)到一定值后，反而會(huì)隨著B(niǎo)和C的上升而下降； 隨著B(niǎo)和D的變化，響應(yīng)值的變化則較平緩(圖1E)；A=-0.05、B=0.13時(shí)，當(dāng)C和D較小時(shí)，提取率也較低，C和D上升后，提取率也增加，當(dāng)提取率達(dá)到最大值后，C和D的增加反而會(huì)使提取率下降，不過(guò)下降的幅度較上升的幅度平緩(圖1F)。

3 討論

提取時(shí)間、提取溫度、液固比和乙醇濃度是影響黃酮提取率的四個(gè)主要因素。提取時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)增加植物體內(nèi)的黃酮溶出，當(dāng)提取達(dá)到一定時(shí)間后，連錢(qián)草黃酮的提取率不再顯著增加，這是因?yàn)榻鲆褐悬S酮與植物內(nèi)的黃酮濃度差縮小，黃酮溶出速度下降。提取溫度41℃時(shí)連錢(qián)草黃酮的提取率最高，隨后溫度的提高反而會(huì)使提取率下降，說(shuō)明高溫可能會(huì)破壞連錢(qián)草黃酮的結(jié)構(gòu)。液固比的增加會(huì)提高植物內(nèi)黃酮與浸出液中黃酮的濃度差，從而加快黃酮的溶出，但當(dāng)液固比過(guò)大時(shí)，會(huì)使后續(xù)處理繁瑣，加大處理過(guò)程中的損耗從而使提取率下降。本研究中乙醇濃度較高時(shí)，連錢(qián)草黃酮的提取率較大，說(shuō)是連錢(qián)草黃酮在高濃度的乙醇溶液中溶解性較好。響應(yīng)面法是優(yōu)化黃酮提取工藝常用的方法之一，本研究通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化的連錢(qián)草黃酮提取工藝得到驗(yàn)證，有很好的實(shí)用性。

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