IGF-1 通過PI3K/Akt 通路抑制MPP+ 誘導PC12 細胞凋亡機制的研究

黃露麒，王萬銘

帕金森病(Parkinson disease，PD)是一種常見的神經系統變性性疾病，其神經病理變化主要以中腦黑質致密帶多巴胺(dopamine，DA)能神經元的丟失為主要特征。目前研究認為，DA 能神經元的丟失可能與細胞凋亡有關。IGF-1 是由70 個氨基酸組成的單鏈多肽物質，是一類促進細胞生長、具有胰島素樣代謝效應的因子，可調控細胞的分化和增殖，并被認為具有抑制凋亡的作用，是一種有效的神經保護劑［1］。但是，IGF-1 對于MPP+誘導處理的PC12 細胞是否有保護作用，這一保護作用是通過那些信號通路尚不十分清楚。本實驗通過MPP+處理PC12 細胞，制備PD 細胞模型，研究IGF-1 對MPP+所致PC12 細胞凋亡的抑制作用及其潛在的作用機制。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 IGF-1 購自以色列Prospec公司，MPP+、MTT、AKT 以及P-AKT 抗體、丫啶橙(AO)和溴化乙啶(EB)染料均購自sigma 公司，DMEM/F12 培養基以及馬血清購自美國Gibco 公司，胎牛血清購自北京四季青公司，BCA 試劑盒購自上海碧云天公司，ECL 試劑盒購自美國Pierce 公司，其余試劑均為國產分析純。

1.2 細胞的培養和處理 未分化的PC12 細胞株(購自中科院上海細胞生物所)以含2.5%胎牛血清，15%馬血清的DMEM/F12 培養基常規培養，選擇指數生長期細胞分別接種于96 孔板(密度3×104個/ml)和24 孔板(密度2×105個/ml)用于細胞狀態的檢查以及提取蛋白。細胞處理分組如下:空白對照組;IGF-1 組:100 nmol/L 的IGF-1 處理4 h;MPP+組:給予250 μmol/L 的MPP+處理4 h;IGF-1+MPP+組:250 μmol/L 的MPP+與濃度為100 nmol/L 的IGF-1 共同處理4 h;MPP++IGF-1+LY294002 組:預先給予PI3K 抑制劑LY294002 處理1 h 以后再給予MPP++IGF-1 處理。之后檢測通路活性以及細胞狀態。

1.3 MTT 實驗方法 調節PC12 細胞密度至4×104/孔(100 μl/孔)接種于96 孔板中，置37 ℃含5% CO2細胞培養箱培養24 h。藥物處理組每組設六復孔，每孔加5 mg/ml MTT10 μl，37 ℃孵育4 h后，每孔加150 μl DMSO 使MTT 被還原而成的甲臢溶解，用平板搖床搖勻，用酶標儀在吸收波長570 nm、參考波長540 nm 處檢測每孔的光密度。各重復孔的OD 值取均數±標準差。細胞存活率=(實驗組A570 值-空白對照組A570 值)/(對照組A570 值-空白對照組A570 值)×100%。

1.4 AO-EB 實驗方法 將培養的PC12 細胞均勻種在24 孔板中，處理24 h 后提取細胞，以PBS洗兩次，以多聚甲醛固定10 min，再PBS 洗，去上清。加入100 μl PBS，輕輕懸起細胞充分混勻，將AO-EB 兩種染料等體積混合，加入細胞懸液中，使終濃度為100 μg/ml，靜置2 min 后滴片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.5 Western blot 實驗方法 按AO-EB 實驗時的分組方式處理細胞，每組設3 復孔，處理4 h 以后收集細胞，提取細胞總蛋白，采用BCA 法進行蛋白定量。取等量蛋白(20 μg)進行10% 的SDSPAGE，100 V 恒壓電泳1 h，250 mmA 恒流轉膜(硝酸纖維素膜)1 h 后用含5%脫脂奶粉的TBST 封膜30 min，一抗孵育過夜，以TBST 洗3 次每次5 min，加二抗孵育1 h，再用TBST 洗3 次，在NC 膜上均勻涂布ECL，孵育1 min 后在暗盒中覆蓋X 光膠片曝光。膠片經掃描、編輯后輸出。

1.6 統計學處理 實驗所得數據應用SPSS12.0 統計軟件進行處理，數據結果采用均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用Duncan 檢驗。P＜0.05 為有統計學意義。

2 結果

2.1 IGF-1 抑制MPP+對PC12 細胞誘導的凋亡作用 MTT 的結果顯示，MPP+(250 μmol/L)處理24 h 后，MPP+的毒性作用使得細胞存活率降至43.1%，與空白對照組相比差異具有統計學意義(P＜0.05)。同時給予100 nmol/L 的IGF-1 處理以后，細胞存活率為82.85%，顯著抑制了由MPP+誘導的凋亡，差異有統計學意義(P＜0.05)。加入PI3K 抑制劑LY294002 后，阻斷了IGF-1 對PC12 細胞的保護作用，細胞存活率為56.26%，較IGF-1+MPP+組下降(見圖1)。

2.2 AO-EB 染色檢測IGF-1 對MPP+所致PC12 細胞凋亡的抑制作用 與對照組相比，MPP+處理組凋亡細胞明顯增多，表現為細胞被染成橘紅色，細胞核固縮，致密深染，核分葉現象多見，并有典型凋亡小體的形成。正常組細胞核染色呈圓形或橢圓形，形態良好呈綠色。MPP++IGF-1 組的橘紅色凋亡細胞明顯減少，正常形態綠色細胞明顯增多。加入PI3K 抑制劑LY294002 后，細胞凋亡較IGF-1+MPP+組增加(見圖2)。

2.3 MPP+致PC12 細胞損傷模型中IGF-1 促進AKT 的磷酸化 正常對照組p-Akt 處于較低水平，MPP+(250 μmol/L)處理后，p-Akt 的表達增加，IGF-1和MPP+共同處理PC12 細胞4 h 后，p-Akt 表達明顯增高，且高于MPP+處理組，而LY294002+IGF-1+MPP+共同處理組p-Akt 表達增高不明顯(見圖3)。

圖1 IGF-1 抑制MPP+對PC12 細胞誘導的凋亡作用

圖2 AO-EB 染色檢測IGF-1 對MPP+所致PC12 細胞凋亡的抑制作用

圖3 IGF-1 促進MPP+致PC12 細胞損傷模型中的Akt 的磷酸化

3 討論

帕金森病是一種常見的神經系統變性性疾病，目前病因尚不完全明確。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)被認為是環境毒素之一。MPP+是MPTP 通過MAO-B 的代謝產物，其細胞毒性作用可導致細胞凋亡。本實驗以MPP+誘導PC12 細胞構建帕金森病細胞模型，并加入IGF-1 予以干預。

IGF-1 是一種神經營養因子，中樞神經系統內有IGF-1 受體的大量表達，如皮質、海馬、紋狀體、丘腦等部位［2］。IGF 能夠促進細胞增殖和存活，抑制其凋亡，參與神經元的保護，在神經系統中有著重要的營養保護作用［3］。IGF-1 在神經系統的生長、分化、修復和再生中起重要作用。本實驗結果顯示，加入IGF-1 后，MPP+導致的細胞凋亡顯著減少。那么在其對MPP+誘導的毒性作用所起到的防護機制中，有哪些可能的信號通路發揮了作用。

近年來研究發現肌酸肌醇3 激酶(PI3K)/Akt信號轉導通路調節細胞生長、凋亡、以及部分重要基因的表達，是細胞內重要的促細胞存活途徑［4］。PI3K 通路可以被IGF-1R 誘導激活，使其下游蛋白激酶Akt 發生磷酸化。Akt 也稱為蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。磷酸化的Akt 可通過各種途徑調節凋亡相關基因的活化狀態，從而起到抑制細胞凋亡及促進細胞存活的作用。Akt 的羧基末端的磷酸化是Akt 激活的必要條件，Akt 激活后可抑制或者促進下游靶蛋白的活性，產生抑制細胞凋亡、促進細胞生存的效應［5］。PKB/Akt 在促進各種類型細胞生存中起中心環節作用。神經生長因子(nerve growth factor，NGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)以及促紅細胞生成素(erythropoiet in，EPO)等均可通過PI3K/Akt 信號轉導通路促進多個神經元細胞系的存活，其刺激細胞生長與生存的反應中均有PKB/Akt 的高表達和活化［6］。PKB/Akt 是體內信號轉導的共同中繼站，尤其是PKB/Akt 是PI-3K 最主要的靶酶，與多種細胞活動、物質代謝調節，特別是抑制細胞凋亡有密切關系。

因此，我們認為PI3K-Akt 通路可能參與了IGF-1 的保護機制。通過蛋白免疫印記法發現:以MPP+處理細胞后，p-Akt 的表達開始增加，以IGF-1 和MPP+共同處理PC12 細胞后，在細胞生存率增高的同時，p-Akt 表達明顯高于MPP+處理組，凋亡細胞明顯減少。而加入抑制劑LY294002 處理后，IGF-1+MPP+共同處理組p-Akt 表達增高不明顯，凋亡細胞較IGF-1+MPP+處理組增多。因此，我們推測LY294002 通過抑制Akt 的磷酸化，使Akt 的活性被抑制，從而對抗了IGF-1 的保護作用。

近年來有研究證實，PI3K/Akt 通路與細胞的凋亡密切相關，其可能涉及以下幾種機制:(1)促使凋亡相關因子磷酸化，抑制其活性，催化BDA 和caspase-3、caspase-9 磷酸化使之失活，抑制caspase促細胞凋亡的作用［7］;(2)抑制糖原合成激酶-3(GSK-3)活性。導致細胞骨架蛋白β-catenin 降解及細胞粘附受抑制，加速細胞凋亡［8］;(3)防止線粒體釋放凋亡因子，抑制其釋放細胞色素C 及凋亡誘導因子AIF、參加執行細胞凋亡過程［9］;(4)抑制促凋亡基因表達、Akt 的生存因子可以依賴或不依賴轉錄調節而達到抗凋亡的作用;(5)調節Bcl-2 家族成員活化［10］。同時，Akt 還可活化CaM 依賴蛋白激酶信號途徑，促進細胞生存。

綜上所述，IGF-1 能夠抑制MPP+誘導PC12 細胞凋亡，其保護機制可能與PI3K-Akt 通路相關，這可能為帕金森病治療藥物的研究提供進一步的依據。

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［10］Trejo JL，Llorens-Martin MV，Torres-Aleman I.The effects of exercise on spatial learning and anxiety-like behavior are mediated by an IGF-I-dependent mechanism related to hippocampal neurogenesis［J］.Mol Cell Neurosci，2008，37(2):402-411.